PI3K/Akt抑制剂对鸡朊蛋白过表达DF-1细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

为探讨PI3K/Akt信号通路在鸡细胞型朊蛋白(ChPrPC)过表达的DF-1细胞(DF-1-PrP)增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrPC表达量的关系,以DF-1-PrP细胞为模型,空载体转染的DF-1-NC细胞和DF-1细胞为对照,分别用0、10、20、50、100、200nmol·L-1渥曼青霉素处理以抑制PI3K/Akt信号通路,检测细胞对鼠尾胶原的黏附能力,Transwell小室法检测细胞侵袭力,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测PRNP基因转录量。结果显示,随着渥曼青霉素浓度的增加,DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1细胞的PRNP基因转录量均减少,其增殖、黏附、侵袭能力相应下降,而总凋亡率均升高;但在低于100nmol·L-1的同一渥曼青霉素浓度下,DF-1-PrP细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于对照组,而总凋亡率均低于对照组。本研究表明ChPrPC的过量表达可促进DF-1细胞增殖、黏附和侵袭,抑制其凋亡,在以上过程中,PI3K/Akt信号通路可能具有重要的作用,渥曼青霉素能有效阻断这一通路,但PI3K/Akt信号通路并不是ChPrPC调节细胞凋亡的唯一途径。     

鸡膜联蛋白A2在DF-1细胞中的表达及亚细胞定位

根据GenBank已发表的鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因序列,设计合成一对特异性引物从DF-1细胞总RNA的反转录产物中扩增鸡ANXA2基因开放阅读框,通过酶切、连接等方法将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1,构建重组真核表达载体pEGFP-ANXA2。利用脂质体转染法将pEGFP-ANXA2转染至DF-1细胞,24 h后分别检测融合蛋白EGFP-ANXA2在细胞中的表达及亚细胞定位情况。结果显示:成功构建了鸡ANXA2基因的重组真核表达载体pEGFP-ANXA2;将其转染DF-1细胞后得到与预期大小相符的EGFP-ANXA2蛋白条带,荧光显微镜观察显示EGFP-ANXA2主要定位在细胞质。研究结果为进一步开展鸡ANXA2在相关家禽病毒复制中的作用研究奠定了基础。     

GADD45β蛋白抑制ALV-J在DF-1细胞中的复制

生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45β(growth arrest and DNA damage 45β,GADD45β)参与多种细胞信号通路,在病毒感染过程中发挥重要作用,但在禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)感染中研究较少.本研究中,用J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染DF-1细胞,通过...     

靶向抑制MAP3K1对小鼠乳腺癌细胞生物学行为的影响

为了在细胞学水平研究靶向抑制MAP3K1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1)基因对小鼠乳腺癌4T1细胞黏附、运动及侵袭能力等生物学行为的影响,试验用体外构建靶向"沉默"MAP3K1基因的amiRNA(artificial microRNA)干扰载体,以X-treme GENE HP转染4T1细胞(干扰组转染amiRNA干扰载体,对照组转染空载体,空白组未转染质粒)对MAP3K1基因mRNA及蛋白表达水平进行检测,以测定干扰效率;分别以黏附试验检测小鼠乳腺癌4T1细胞的黏附能力,用划痕-愈合试验与Transwell侵袭试验测定小鼠乳腺癌4T1细胞的运动与侵袭能力。结果表明:小鼠乳腺癌4T1细胞转染MAP3K1 amiRNA-3干扰载体与空载体后,干扰4T1细胞MAP3K1 mRNA水平及蛋白水平均被有效抑制,干扰效率高达70%(P0.01)。试验组4T1细胞黏附能力极显著低于对照组(P0.01);干扰组4T1细胞的运动与侵袭能力均显著低于对照组(P0.05)。说明构建的amiRNA干扰载体能够有效抑制靶基因MAP3K1的表达,并能够显著抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的黏附、运动与侵袭能力;靶向抑制MAP3K1基因能够广泛地影响小鼠乳腺癌4T1细胞的生物学行为。     

TLR2介导鸡毒支原体脂质相关膜蛋白诱导DF-1细胞表达IL-1β的研究

Toll样受体2(TLR2)在鸡毒支原体(MG)诱导天然免疫反应机制中的作用尚未明确。为鉴定TLR2在MG脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导细胞表达IL-1β中的作用,本研究通过RT-PCR和ELISA方法检测LAMPs刺激后DF-1细胞中IL-1β的m RNA和蛋白水平,结果显示LAMPs可以诱导DF-1细胞分泌IL-1β,并确定最佳刺激时间为6 h,最佳刺激剂量为1μg/m L。此外,通过构建TLR2重组表达质粒p CMV-HA-TLR2,并将该质粒转染DF-1细胞进行过表达及通过抗体封闭TLR2的两种处理方式,处理后采用LAMPs刺激细胞。经检测显示:TLR2过表达处理组的IL-1βm RNA和蛋白水平显著升高,而抗体处理组的IL-1βm RNA和蛋白水平下调。结果表明,LAMPs能够与DF-1细胞膜上的TLR2受体结合,有效的诱导DF-1细胞表达并分泌IL-1β,而且IL-1β的释放可能与天然免疫系统的经典通路即NF-κB信号通路调控有关。本研究为阐述MG的致病机制提供相关实验依据。     

禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响,为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058株基因组DNA为模版,通过PCR扩增回收ompA基因片段,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过酶切及测序鉴定筛选阳性的重组表达质粒pEGFP-N1-ompA;随后将质粒转染至鸡胚成纤维细胞DF-1并通过Western blotting和免疫荧光试验检测OmpA蛋白的表达情况;通过透射电子显微镜、免疫荧光试验及Western blotting方法检测OmpA对DF-1细胞自噬的影响。【结果】测序鉴定正确的重组质粒pEGFP-N1-ompA经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得大小分别为1 038和4 700 bp的条带,大小与载体和目的片段相符,表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒经脂质体转染DF-1细胞后,通过免疫荧光试验可观察到大量绿色荧光,Western blotting检测到大小为...     

gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响

为了解gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响,将人工合成的gga-miR-155模拟物、gga-miR-155抑制物以及阴性对照瞬时转染MDCC-MSB1细胞。然后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MDCC-MSB1细胞中gga-miR-155的表达水平,CCK-8法检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测MDCC-MSB1细胞的细胞周期与凋亡的变化,Transwell检测MDCC-MSB1细胞的迁移、侵袭能力的变化。结果显示,gga-miR-155模拟物可显著上调MDCC-MSB1细胞gga-miR-155表达水平,促进MDCC-MSB1细胞增殖,细胞G1期细胞减少,S和G2期细胞增加,同时凋亡减少,迁移、侵袭能力增加;gga-miR-155抑制物可显著下调MDCCMSB1细胞gga-miR-155表达水平,抑制MDCC-MSB1细胞增殖,细胞G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时凋亡增加,迁移、侵袭能力下降。结果表明,gga-miR-155可促进MDCC-MSB1细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。     

青蒿琥酯对鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子侵入DF-1细胞的影响

为研究青蒿琥酯(ARS)对柔嫩艾美耳球虫子孢子(SP)侵入DF-1细胞的影响,本实验利用ARS分别处理SP和DF-1细胞,前者经特定荧光标记后,流式细胞仪检测细胞凋亡、SP线粒体膜电位和侵入率。结果显示,ARS(2.5μmol/L)处理DF-1细胞12 h与未处理组相比,细胞凋亡率无明显差异。与空白对照组相比,ARS直接处理SP 2 h,可使SP线粒体膜电位下降33.97±8.40%,并使其对细胞的侵入率下降4.13±3.97%。ARS直接处理细胞2 h和12 h后,再加入SP,则其侵入率分别下降7.23±2.74%和53.67±0.74%。细胞和SP混合后用ARS处理12 h,其侵入率下降56.30±1.81%。若在ARS处理的同时加入凋亡抑制剂米酵菌酸,可以使SP的侵入率提高9.70±0.60%(p0.01)。这表明ARS作用于细胞后对SP侵入的抑制作用更为明显,并具有显著的时间效应。本研究为青蒿素类药物抗球虫作用机理研究提供实验依据。     

不同铜源对鸡嗉囊Ctr1、Ctr2基因和蛋白表达的影响

试验选择105只1日龄的SPF蛋鸡,随机分为7组,每组15只鸡。对照组饲喂低铜半纯化日粮;试验组为在基础日粮中分别添加铜8 mg/kg的Cu SO4、微米Cu O和纳米Cu O组及在基础日粮中分别添加铜160 mg/kg的Cu SO4、微米Cu O和纳米Cu O组。研究不同水平Cu SO4、微米Cu O和纳米Cu O对鸡嗉囊铜转运蛋白基因Ctr1、Ctr2 mRNA相对表达量及蛋白表达量的影响,探讨纳米Cu O在嗉囊的吸收和转运机制。结果表明:试验至15 d,日粮中添加铜160 mg/kg,Cu SO4组雏鸡嗉囊铜含量和Ctr1蛋白表达量显著高于对照组、微米Cu O和纳米Cu O组(P0.05)。试验至30 d,日粮中添加铜8 mg/kg,Cu SO4和纳米Cu O组雏鸡嗉囊铜含量和平均日增质量显著高于对照组和微米Cu O组(P0.05);Cu SO4组雏鸡嗉囊Ctr1 mRNA相对表达量显著高于对照组(P0.05),Cu SO4组雏鸡嗉囊Ctr1蛋白表达量显著高于对照组和微米Cu O组(P0.05),对照组和微米Cu O组显著高于纳米Cu O组(P0.05);日粮中添加铜160 mg/kg,对照组雏鸡嗉囊Ctr1蛋白表达量显著高于Cu SO4组,Cu SO4组显著高于微米Cu O组,微米Cu O组显著高于纳米Cu O组(P0.05)。日粮中添加铜8和160 mg/kg,各组雏鸡嗉囊Ctr2 mRNA相对表达量无显著差异(P0.05),纳米Cu O组雏鸡嗉囊Ctr2蛋白表达量显著高于对照组、Cu SO4和微米Cu O组(P0.05)。可以看出,日粮中添加Cu SO4和纳米Cu O显著提高雏鸡嗉囊铜含量和平均日增质量,微米Cu O没有明显变化。嗉囊Ctr1对Cu SO4的吸收转运发挥重要的作用,Ctr1与纳米Cu O的吸收转运关联不甚密切,纳米Cu O与Cu SO4的吸收转运方式有较大差异。日粮中添加纳米Cu O显著提高雏鸡嗉囊Ctr2蛋白表达,嗉囊Ctr2与Cu SO4吸收转运关系不明显。     

朊蛋白多肽PrP 106-126对N2a细胞活性及PrP mRNA表达的影响

朊病(prion disease)是由正常细胞朊蛋白PrPC错误折叠成异常朊蛋白(朊病毒)引起的.朊病毒的神经致病性在病理学上表现为神经元空泡化、神经元丧失和胶质增生等.     

DENND1B蛋白对AP2B1蛋白细胞中表达及分布影响的研究

为探究含DENN结构域蛋白1B (DENND1B)对网格蛋白依赖性内吞接头蛋白复合体(AP-2)的β亚基(AP2B1)的影响,本实验利用si RNA干扰技术以及慢病毒包装过表达系统改变DENND1B蛋白的表达水平,通过荧光定量PCR(qPCR)、western blot以及激光共聚焦技术研究DENND1B蛋白对AP2B1蛋白的表达以及细胞内定位的影响。结果显示:DENND1B蛋白沉默后能够下调AP2B1蛋白的表达,而过表达DENND1B后能够上调AP2B1蛋白的表达,并且干扰DENND1B蛋白表达后能够显著性地改变AP2B1在细胞内的定位(p0.05),使AP2B1蛋白由核周聚集改变为胞质弥散分布。上述结果表明DENND1B蛋白能够调控AP2B1蛋白的表达以及细胞定位。本实验为研究接头蛋白以及网格蛋白依赖性的质膜内吞途径提供了新的切入点。     

柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶真核表达质粒的构建及其在DF-1细胞中的表达

为了构建柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Eimeria tenella serine/threonine protein kinase,Et STK)基因的真核表达重组质粒,并实现在DF-1细胞中的表达,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增Et STK基因,将扩展产物与真核表达质粒pc DNA3.1-flag连接,构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-flag-Et STK,测序鉴定正确后,转染DF-1细胞进行表达,利用Western blot和间接免疫荧光(indirect immunofl uorescene assay,IFA)对其表达情况进行鉴定。结果表明重组质粒pc DNA3.1-flag-Et STK构建成功。Western blot显示在54 k Da处出现条带;IFA检测到特异性的绿色荧光,表明构建的重组质粒pc DNA3.1-fl ag-Et STK成功地在DF-1中实现了表达。本研究结果为深入了解柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的功能及球虫核酸疫苗提供了基础。     

猪NLRP3基因克隆及其在DF-1细胞的表达

NLRP3蛋白作为NLRP3炎性小体的主要组成蛋白之一,在机体对抗病原微生物和炎症反应中起着重要作用。为了深入研究猪的NLRP3蛋白在炎性疾病发生过程中的作用机制,采用PCR的方法扩增了长白猪NLRP3基因,并对其序列和编码蛋白的结构进行了分析。构建了pIRES2-EGFP-NLRP3真核表达载体,并转染至DF-1细胞中进行表达。结果显示,该基因表现出种属内保守性和种属间差异性,编码蛋白由1 036个氨基酸构成,存在4个潜在跨膜区,分别是第401~419,第721~739,第775~795和第889~910位氨基酸,不含信号肽。单层细胞免疫化学检测结果显示,重组质粒pIRES2-EGFP-NLRP3成功转染并在细胞中表达。本研究为深入探讨炎症小体在猪炎症性疾病的作用机制提供了基础数据。     

IBDV和NDV共感染对DF-1细胞的协同致病作用

为研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)共感染对DF-1细胞的致病作用,本试验将IBDV和NDV以单独/共同形式感染DF-1细胞,镜下观察可见共感染组最早在感染48 h后出现细胞病变现象(CPE),其他感染组在72 h后出现明显CPE;细胞活性检测结果显示共感染组在48 h出现明显下降,在72 h显著低于其他组。感染上清中共感染组与单感染组病毒增殖曲线基本一致,均表现为24～72 h处于病毒增殖期。荧光定量PCR检测结果显示,共感染组细胞内NDV核酸载量均显著高于单感染组,其IBDV核酸载量在48 h高于单感染组;共感染组MDA5转录水平在24 h显著低于其他组,在48 h显著高于其他组;各感染组Ⅰ型IFN转录水平受到明显抑制,其中共感染组IFN-β转录水平显著低于单感染组。本研究结果表明IBDV与NDV共感染导致细胞病变加剧并促进胞内病毒复制,明确了病毒共感染具有协同致病作用;还发现病毒共感染导致MDA5-IFN信号通路出现异常,这为下一步解析IBDV与NDV共感染对宿主天然免疫系统的影响及协同致病机制奠定基础。     

牦牛和双峰驼重组朊蛋白的原核细胞表达

应用重组DNA技术构建了牦牛和双峰驼重组朊蛋白的4个表达载体，即pGEX-BoPrP（23～242）、pGEX—BoPrP（100～242）、pGEX—CaPrP（25～241）和pGEX—CaPrP（93～241），经转化E．coli BL21（DE3），成功地获得了重组菌E．coli BoPrP（23～242）、E．coli BoPrP（100～242）、E．coli CaPrP（25～241）和E．coli CaPrP（93～241），分别可表达大小约为50．2、41．7、49．9和42．4ku的融合蛋白。各重组菌经1．0mmol／L的IPTG于37℃诱导5～6h可产生占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。免疫印迹分析表明，除融合蛋白GST—BoPrP（100～242）外，GST—BoPrP（23～242）、GST—CaPrP（25～241）和GST—CaPrP（93～241）均可与抗牛单克隆抗体4C11反应，显示中国黄牛PrP^c与牦牛和双峰驼PrP^c具有共同的抗原成分。     

红嘴鸥TLR7蛋白多克隆抗体制备及在DF-1细胞中的表达特征分析

【目的】制备红嘴鸥Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)蛋白多克隆抗体,分析红嘴鸥TLR7蛋白在DF-1细胞中的表达特征,为深入了解红嘴鸥TLR7蛋白功能及作用机制提供材料。【方法】设计引物扩增红嘴鸥TLR7基因CDS区,并构建其原核表达载体与真核表达载体。将重组原核表达质粒pET32a-TLR7转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞进行重组蛋白体外诱导表达,并对其诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化筛选。选用新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测血清抗体价效,利用Western blotting鉴定抗体特异性。将真核表达质粒pcDNA3.1-TLR7转染至DF-1细胞中过表达,利用间接免疫荧光技术检测红嘴鸥TLR7蛋白在转染DF-1细胞后不同时间点的表达特征。【结果】红嘴鸥TLR7基因CDS区长约1 182 bp,双酶切结果显示出2组大小不同的2条片段,分别为5 900、1 182 bp(原核表达载体)和5 428和1 182 bp(真核表达载体),测序后表明原核表达载体与真核表达载体构建成功。体外诱导温度为30℃、IPT...     

鸡毒支原体GroEL蛋白通过NF-κB信号通路诱导DF-1细胞释放IL-1β的研究

鸡毒支原体(MG)脂质相关膜蛋白(LAMPs)在刺激宿主细胞天然免疫中起重要作用,GroEL蛋白是本实验室前期利用质谱鉴定筛选出的LAMPS中的关键组分。为研究GroEL蛋白诱导宿主细胞炎性反应的信号通路,本研究通过原核表达系统表达出MG的GroEL蛋白,利用激光共聚焦试验、荧光定量PCR和western blot方法分别检测GroEL蛋白的粘附特性、p65入核、磷酸化水平及IL-1β分泌情况。激光共聚焦试验结果显示,GroEL蛋白能够黏附于DF-1细胞表面并刺激DF-1细胞中p65从胞浆转入细胞核;western blot检测显示GroEL蛋白能够激活NF-κB信号通路促进p65磷酸化水平提高;荧光定量PCR检测显示GroEL蛋白能够促进IL-1β释放,当NF-κB信号通路被抑制后,IL-1β的释放显著下降(p0.01)。本研究结果表明MG GroEL蛋白能够粘附于宿主细胞表面并通过激活NF-κB信号通路诱导宿主细胞IL-1β的释放,从而在炎症反应中发挥作用。本研究为深入研究MG致病机制提供了实验依据。     

类朊蛋白Shadoo基因在Neuro-2α中的表达及细胞定位分析

为构建鼠类朊蛋白Shadoo基因重组真核表达质粒,并分析类朊蛋白Shadoo在鼠神经瘤细胞(Neuro-2α)内表达及定位.采用PCR方法把Flag标签序列插入到Shadoo阅读框122与123氨基酸住点之间,构建Shadoo-Flag融合基因片段,把Shadoo-Flag片段插入到真核表达质粒pcDNA3.1,构建重组真核表达pcDNA3.1-Shadoo-Flag,质粒酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转入Neuro-2α细胞,检测Shadoo基因表达及表达部位.结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-Shadoo-Flag转入Neuro-2α细胞,能够正确表达出相对分子质量为12 000的Shadoo蛋白,并定位于细胞膜.     

丝素蛋白生物材料对细胞行为的影响

生物材料的相容性一直是组织工程和再生医学领域的重要议题.组织细胞能对外界环境作出不同的响应,但只有在天然生长环境中(细胞外基质)细胞才能发挥其正常的功能.因此构建基于丝素蛋白的仿生生物材料是处理生物相容性的可行途径之一.本文介绍了细胞与细胞外基质相互作用的机理,总结了近年来丝素来源的生物材料影响细胞黏附、迁移、增殖和分化等行为的因素,包括材料的化学成分、拓扑结构(纤维尺寸、支架孔径和表面特性)以及力学特性,并在此基础上讨论了存在的问题及今后的发展方向,为设计新一代的生物材料提供参考和借鉴.     

牛朊蛋白和酵母朊毒体结构域融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将酵母Ure2p朊蛋白结构域(UPD)基因插入牛朊蛋白(BPrP)表达质粒pET-PrP中,构建原核表达载体pET-PrP-UPD.阳性质粒转化宿主菌BL21 (DE3),在IPTG诱导下获得高效表达.Westernblot检测表明表达的重组蛋白与单克隆抗体6H4呈现特异性反应,且纯化的PrP-UPD融合蛋白在体外具有聚集成淀粉样纤维、抵抗蛋白酶K消化等朊毒体的结构特点.利用纯化的PrP-UPD免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经克隆和筛选,获得3株稳定分泌抗重组PrP单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G3、3A4、4D1,其中1G3分泌的单抗能识别细胞型牛朊蛋白,其Ig亚类为IgG2b,腹水ELISA效价为1×105,Western blot表明该单抗具有较强的特异性.