细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达及诊断价值的初步评价

探究细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基本特性并初步评价其诊断价值,旨在为细粒棘球绦虫的防控提供依据。本研究原核表达出Eg-cystatin重组蛋白并对其进行生物信息学、免疫印迹分析,用荧光免疫定位的方法检测该蛋白质的分布情况,并以绵羊细粒棘球蚴阳性血清评价Eg-cystatin重组蛋白的诊断价值。结果如下:Eg-cystatin生物信息学分析结果显示,该蛋白质含有一个N端信号肽以及cystatin结构域,是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制剂,进化树分析显示Eg-cystatin属于绦虫cystatinⅡ型,并且与其他绦虫的cystatin相似性为72.20%~80.66%,免疫荧光定位发现该蛋白质主要分布在原头蚴的表皮和顶突钩,生发层,成虫虫体内部和虫卵。基于Eg-cystatin建立的间接ELISA方法的特异性为79.1%,敏感性为83.3%,与剖检符合率为81.25%。Eg-cystatin在成虫和幼虫时期均有表达,提示该基因与虫体生命活动息息相关,但Eg-cystatin蛋白不适合作为绵羊细粒棘球蚴病的诊断抗原候选。     

细粒棘球绦虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达及其分子特征的生物信息学分析

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的关键酶,现已发现该酶可作为一些寄生虫的疫苗候选分子和药物靶标。然而,有关绦虫三磷酸甘油醛脱氢酶的研究报道较少。为探究细粒棘球绦虫GAPDH(EgGAPDH)的分子特征与应用价值,克隆细粒棘球绦虫的GAPDH基因,并以生物信息学方法对其进行系统的分析。结果显示:EgGAPDH基因全长1 011bp,编码336个氨基酸。EgGAPDH是由4个结构相同的单体蛋白(O、P、Q、R)组成的一个同源四聚体,每个单体蛋白质含有3个活性中心,即NAD+绑定区域(aa 4-151和aa 315-336)、催化结合区域(aa 156-314)和一个酶活性位点(aa 149-156)。通过对EgGAPDH的氨基酸序列的抗原表位预测得到了16个B细胞抗原表位和9个T细胞结合位点;Western blot显示原核表达的重组EgGAPDH能与感染细粒棘球蚴的小鼠血清发生特异性结合;以纯化的重组EgGAPDH蛋白为抗原通过ELISA法检测17份细粒棘球蚴小鼠阳性血清,阳性检出率为100%。试验结果表明:成功克隆并表达细粒棘球绦虫的EgGAPDH基因,EgGAPDH蛋白具有3个酶功能区域和多个免疫结合位点,Western blot和ELISA结果显示,该蛋白质可能具有作为抗细粒棘球蚴的药物靶标和疫苗候选分子的潜力。     

绵羊细粒棘球蚴全血金标渗滤检测方法的建立

为建立一种快速、高效的诊断家畜细粒棘球蚴病方法,提取绵羊细粒棘球蚴包囊新鲜囊液,盐析囊液抗原,点样于硝酸纤维膜,以胶体金-驴抗羊IgG和胶体金-兔抗鼠IgG为检测标记物,采用垂直流渗滤装置检测绵羊与人工感染细粒棘球蚴小鼠血清和全血特异性抗体。患病绵羊阳性血清及全血检出率在90.91%~94.4%,细粒棘球蚴感染小鼠血清及全血检出率均为100%;细粒棘球蚴阴性羊血清和全血假阳性率为4.00%~4.59%;与脑多头蚴病血清交叉反应率为28.57%(2/7)。研究结果表明细粒棘球蚴全血金标渗滤法(DIGFA)可应用于绵羊棘球蚴病的诊断与检疫。     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础.将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定.同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测.结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性.同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性.EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础.     

细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单抗的制备及夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种早期诊断动物细粒棘球蚴病的方法,诱导表达含PET-EgAgB8/2载体的原核表达菌,以表达纯化蛋白为抗原,制备单克隆抗体,并以制备的抗体建立检测细粒棘球蚴病夹心ELISA方法。结果显示,原核表达菌在37℃诱导培养,菌体上清中大量表达,经验证为目的蛋白,用纯化蛋白免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选得到9株具有良好特异性、稳定分泌单克隆抗体的细胞株,经两两配对,选择75C86/15作为包被抗体,27E57/32为酶标二抗,当包被抗体浓度为1.42μg/mL, 4℃包被过夜、用含50 g/L脱脂奶粉的PBST封闭、抗原作1∶100稀释、酶标二抗1∶1 000稀释、反应底物作用15 min时效果最佳,检测方法的特异性为98.8%,敏感性为95.3%。成功制备细粒棘球蚴抗原B8/2蛋白单克隆抗体并建立了ELISA检测方法。     

羊细粒棘球蚴病抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在通过建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.作者利用DNAStar软件对GenBank上发表的细粒棘球蚴EG95蛋白的氨基酸序列进行分析,筛选出高度亲水的优势表位区EG95s,对该区域编码基因进行克隆并表达.以纯化的重组融合蛋白为包被抗原,按常规方法建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA,并对各种条件进行优化.SDS-PAGE结果表明成功获得了可溶性好、表达效率高、纯化简便的重组融合蛋白GST-1EG95s和HIS-1EG95s,Western blot检测结果表明表达产物具有较好的反应原性.间接ELISA方法优化结果显示:HIS-1EG95s作为包被抗原效果优于GST-1EG95s.经统计学分析,确定间接ELISA方法的判定标准:OD450nm值≥0.235时判定为阳性,OD450nm值≤0.191时判定为阴性,介于二者之间则为可疑.分别对采自新疆的70份羊包虫阳性血清和70份阴性血清进行检测,结果表明该方法与新西兰Wallaceville动物研究中心提供的间接ELISA方法符合率为100%,阻断试验结果显示与其他蛋白无交叉反应,批内变异系数介于3.8%～5.6%,批间变异系数介于5.7%～8.5%,结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好.作者所建立的羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA检测方法有望为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95- (C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。     

多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基基因的克隆及原核表达

为鉴定多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基（TmPKA-C）基因作为诊断抗原的潜能,本试验以多头带绦虫成虫RNA为模板,利用RT-PCR扩增TmPKA-C基因。将TmPKA-C基因片段连接至pET-30a原核表达载体进行原核表达,然后利用Western blotting和间接ELISA分析该蛋白的反应原性。结果表明,TmPKA-C基因开放阅读框的长度为1 032 bp,可编码343个氨基酸。TmPKA-C基因的表达产物主要以包涵体的形式存在,重组蛋白的分子质量大小约42 ku。Western blotting结果表明,该重组蛋白既能与自然感染脑多头蚴的绵羊血清发生特异性反应,又能与人工感染脑多头蚴不同时间段的绵羊血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA分析结果表明,脑多头蚴绵羊血清能与重组蛋白发生特异性反应,进一步证明该重组蛋白的反应原性良好。本研究为筛选脑多头蚴病诊断新抗原奠定了基础。     

TGF-β1和Collagen-Ⅲ在牦牛感染细粒棘球蚴肝纤维化中的表达

研究转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅲ型胶原(Collagen-Ⅲ)在牦牛感染细粒棘球蚴导致肝纤维化中的表达及其意义。收集西藏地区40例细粒棘球蚴感染的牦牛肝组织和血清样本,同时收集未感染的肝组织和血清进行对照。采用苏木素-伊红(HE)染色法和天狼猩红染色法观察牦牛肝脏病理变化和肝纤维化程度;酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组化法(IHA)分别检测肝组织和血清中TGF-β1、Collagen-Ⅲ的表达水平及分布;RT-PCR检测肝细胞内TGF-β1和Collagen-Ⅲ基因mRNA的相对表达水平。HE染色和天狼猩红染色结果显示,与未感染细粒棘球蚴病牦牛肝组织相比,感染棘球蚴周围的肝组织肝界板细胞破坏,呈虫蚀状,感染肝组织外围纤维化,细粒棘球蚴寄生的牦牛肝脏组织引起组织增生,纤维化;ELISA结果显示感染细粒棘球蚴牦牛血清样中细胞因子TGF-β1、Collagen-Ⅲ的含量明显超过未感染组(P<0.05),且免疫组化的结果显示它们的表达主要存在于细胞基质中;RT-PCR显示细粒棘球蚴感染肝组织中TGF-β1、Collagen-Ⅲ的mRNA相对表达量超出未感染组(P<0....     

弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D基因的原核表达及蛋白定位研究

为表达弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(surface antigen glycoprotein 1-related sequences,SRS47D)并确定其在弓形虫中的定位,本研究将SRS47D基因序列插入原核表达载体pColdⅠ,构建原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性;利用His柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,制备抗血清,通过间接ELISA检测血清效价;利用免疫荧光法检测蛋白在弓形虫速殖子中的定位。结果显示:成功构建了原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,表达产物约为55 kDa;重组蛋白能与感染弓形虫的小鼠血清发生特异性反应,免疫兔血清效价达到1∶51 200;免疫荧光检测结果显示,SRS47D蛋白分布在弓形虫速殖子表面,尤其前部和后部表膜。上述结果为进一步深入研究弓形虫SRS47D的特性和功能奠定了基础。     

细粒棘球蚴细胞系(13G-5)细胞代谢抗原的免疫原性和反应原性

应用培育成功的人源细粒棘球蚴细胞系(13G-5)细胞的天然代谢抗原,接种昆明小鼠,于接种后第14天给免疫小鼠接种人源细粒棘球蚴原头节约1 000 个,于200 d 剖检观察有无包囊形成,病理切片鉴定;并用该抗原作为诊断抗原,使用间接血凝(IHA)、琼脂扩散(AGD)试验,检测临床确诊的细粒棘球蚴病人血清。以多房棘球蚴病人血清、细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清作为对照。结果表明,该抗原能使60% 的小鼠获得完全抵抗细粒棘球蚴原头节攻击的能力,未完全获得保护的小鼠形成包囊的数量、大小较对照组明显减少,且为不育囊;使用该抗原IHA 检测31 份血清,阳性24 份,阳性率77.42% ,AGD检测30 份血清,阳性13 份,阳性率43.33% ,2 种方法对多房棘球蚴病人血清和细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清不起反应。     

细粒棘球蚴14-3-3重组抗原诱导小鼠体液免疫应答的研究

为研究细粒棘球绦虫原头蚴(Eg)重组蛋白14-3-3(r Eg14-3-3)诱导小鼠的免疫反应以及其对小鼠的免疫保护力,本研究将r Eg14-3-3免疫ICR小鼠,在三免后4周,采用原头蚴攻击感染,并采用ELISA法对小鼠血清中Ig G及其亚型、Ig E抗体水平和IL-21细胞因子水平进行检测。结果表明:免疫组小鼠血清Ig G、Ig G1、Ig G2a水平显著高于对照组(p0.05),Ig E水平则无显著性差异。免疫组小鼠和对照组小鼠在免疫后和攻击感染后IL-21水平迅速升高并在较长时间内维持相对较高水平;而且免疫组保护效率为84.47%。本研究表明r Eg14-3-3能够诱导小鼠产生高水平的特异性体液免疫反应,并且Tfh细胞也参与体液免疫应答,表明该重组蛋白可以作为预防Eg的候选亚单位疫苗或重组疫苗的有效免疫抗原。     

细粒棘球蚴细胞系（13G—5）细胞代谢抗原的免疫性和反应原性

应用培育成功的人源细粒棘球蚴细胞系（１３Ｇ－５）细胞的天然代谢抗原，接种昆明小鼠，于接种后第１４天给免疫小鼠接种人源细粒棘球蚴原头节约１０００个，于２００天剖检观察有无包囊形成，病理切片鉴定；并用该抗原作为诊断怕，使用间接血凝（ＩＨＡ）、琼脂扩散（ＡＧＤ）试验，检测临床确诊的细粒棘球蚴病人血清，以多房棘球细病人血清、细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清作为对照。结果表明，该抗原能使６０％的小鼠获工抗细粒棘     

绵羊包虫病的ELISA诊断实验

在屠宰场通过肝脏观察采集健康的和疑似感染棘球蚴的绵羊血清通过ELISA试剂盒诊断,对ELISA试剂盒的准确性和敏感性进行了评估,发现越是感染后期它的敏感性越高,而在活体中对细粒棘球蚴或多头棘球蚴正确的免疫诊断却比较困难。     

细粒棘球蚴14-3-3重组蛋白免疫小鼠T淋巴细胞亚群的动态研究

为研究细粒棘球蚴14-3-3(r Eg14-3-3)重组蛋白免疫小鼠的细胞免疫机制,本研究利用r Eg14-3-3、弗氏佐剂和PBS分别免疫3组ICR小鼠,每隔两周免疫一次,在第三次免疫后4周,以原头蚴攻击感染,采用流式细胞术分别检测免疫后0、2、4、6、10、18、30周小鼠外周血中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的百分率。攻击感染24周后迫杀鼠,检获棘球蚴包囊数并计算减囊率。结果表明:与对照组相比,r Eg14-3-3免疫组CD4~+T细胞和CD8~+T细胞在原头蚴感染后均显著增高,rEg14-3-3蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为84.47%。本研究表明r Eg14-3-3免疫小鼠在原头蚴攻击感染后T淋巴细胞数量显著增加,该重组蛋白能够诱导有效的抗感染细胞免疫应答。     

用ELISA法观察模型小鼠原发性感染细粒棘球绦虫后特异性抗体的变化规律

分别用较高纯度的细粒棘球绦虫六钩蚴抗原和传统使用的囊液抗原对一次感染和二次感染细粒棘球绦虫六钩蚴的小鼠血清进行ELISA测定，认为寄生于不同部位的包囊刺激机体产生的抗体水平不同．同时检测早期抗体时，六钩蚴抗原比囊液抗原更具有阶段性优越性。小鼠二次感染六钩蚴后六钩蚴抗体水平得到明显加强，并推测认为一次感染产生的六钩蚴抗体可能是具有保护性的抗体。     

体外孵化六钩蚴获取抗原诱导羔羊对棘球蚴病的免疫

细粒棘球绦虫六钩蚴在体外孵化十四天,培养物经用弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)混合浓缩和乳化,然后注入羔羊。之后羔羊对细粒棘球绦虫虫卵食入感染有很强的抵抗力。人工感染时采自免疫羔羊的血清体外试验杀灭六钩蚴非常有效。     

绵羊包虫病的ELISA诊断试验

在屠宰场通过肝脏观察采集健康的和疑似感染棘球蚴的绵羊血清通过ELISA试剂盒诊断．对ELISA试剂盒的准确性和敏感性进行了评估．发现越是感染后期它的敏感性越高，而在活体中对细粒棘球蚴或多头棘球蚴正确的免疫诊断却比较困难。     

细粒棘球绦虫EgM123基因的原核表达与免疫原性检测

为了验证EgM123表达蛋白的免疫原性功能,建立犬细粒棘球绦虫EgM123基因的原核表达和蛋白纯化体系,为EgM123蛋白单克隆抗体制备与基因重组疫苗的研制提供研究基础。本试验通过构建EgM123基因原核蛋白表达载体及其蛋白表达条件优化、利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化、SDS-PAGE（聚丙烯酰氨凝胶电泳）和Western blotting（蛋白质印迹）试验对表达蛋白的分子量和免疫原性进行检测,并通过间接酶联免疫吸附（ELISA）方法对所表达的EgM123蛋白的抗原功能进行验证。本试验通过菌液聚合酶链式反应（PCR）扩增和双酶切验证成功构建EgM123基因原核蛋白表达载体;优化出最佳诱导条件为37℃、表达时间为7h下表达量最高;Western blotting显示其在28KDa处均有特异性条带;ELISA显示纯化后的蛋白能很好的与EgM123多克隆抗体结合。上述结果表明EgM123表达蛋白极具免疫原性,可用于免疫BALB/c小鼠制备EgM123单克隆抗体。     

细粒棘球蚴Eg95重组蛋白疫苗临床免疫效果研究

为评价细粒棘球蚴Eg95重组蛋白的临床免疫效果,本研究利用ELISA试剂盒对3个地区12个养殖场的1 637头3月龄~4月龄绵羊与山羊进行了18个月的免疫后抗体滴度水平监测。结果显示,Eg95重组蛋白疫苗在14 d时可以诱导免疫动物产生特异性抗体,抗体滴度水平在28 d达到峰值,免疫保护大于3个月。而且在首次免疫后第28 d进行第二次免疫,则抗体滴度水平呈显著增加(p0.05),并可持续12个月以上。在第二次免疫后12个月再次进行免疫,动物的Eg95特异性抗体水平显著性提高,并且差异极显著(p0.01),抗体滴度长期保持在3.5以上。因此,细粒棘球蚴Eg95重组蛋白免疫效果良好,可以有效预防棘球蚴(包虫)病。