转录组揭示马卵母细胞体外成熟的重要候选基因

本研究以马GV和体外成熟的MII期卵母细胞为研究样本,进行转录组测序,旨在筛选影响马卵母细胞成熟的关键候选基因。结果表明,马卵母细胞体外成熟率为37.18%;马GV和体外成熟的MII卵母细胞具有不同的mRNA谱,其中9969个mRNA差异显著,进一步的GO和KEGG分析发现,差异表达基因（DEGs）参与了多种可能与卵母细胞减数分裂相关的生物学和信号通路。本研究提供了马卵母细胞体外成熟前后转录组的详细信息,为后续探究关键差异基因对卵母细胞成熟的影响及提高卵母细胞成熟的可行性提供理论依据。     

西藏牦牛卵母细胞蛋白质组表达谱的构建与分析

用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术构建西藏牦牛生发泡(GV)期去透明带卵母细胞的蛋白质组表达谱并进行生物信息学分析。结果显示:共鉴定到550种蛋白质,相对分子质量主要分布在200 000以下,等电点集中在4~12,穹隆蛋白(MVP)是丰度最高的蛋白质;聚类(GO)分析表明:与细胞组分相关的蛋白质主要集中在细胞质(125种),与分子功能相关的蛋白质中发挥多聚A结合RNA功能的蛋白质最多(54种),生物学进程相关的蛋白质中参与内肽酶活性的负调节过程的蛋白质最多(26种);调控通路富集(KEGG Pathway)分析发现,参与的有代表性的通路有补体系统通路,核糖体代谢通路,磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K-Akt)信号通路,碳代谢通路等;通过蛋白质互作网络分析,筛选出与网络稳定性关系最密切的10种蛋白质。总之,构建的西藏牦牛GV期卵母细胞蛋白质组表达谱及分析结果,将为探索西藏牦牛卵母细胞成熟机理及关键基因的研究等奠定基础。     

猪GV/MⅡ期卵母细胞miRNAs表达谱及Npm2基因相关miRNAs筛选

旨在探索体外成熟前后猪卵母细胞miRNAs表达谱，并筛选参与调控Npm2基因表达的miRNAs。本试验回收屠宰场猪卵巢，收集GV期卵母细胞，经体外成熟培养后获得MⅡ期卵母细胞，分别提取约130个GV期和MⅡ期卵母细胞总RNA进行Illumina HiSeqTM 2500测序，获取miRNA测序数据，每个处理重复3次，筛选差异表达microRNAs并进行靶基因GO和KEGG聚类分析。结果表明，本研究成功构建了GV期和MⅡ期猪卵母细胞miRNAs表达谱，GV期和MⅡ期卵母细胞差异表达miRNAs有95个，具有相似表达模式的miRNA聚为一类，对95个差异表达miRNAs进行靶基因预测，共得到3 967个靶基因，经GO和KEGG富集分析表明，这些靶基因被富集于5 194个GO条目和212个信号通路，其中参与卵母细胞减数分裂成熟的信号通路有2个。在差异表达miRNAs中筛选到5个与Npm2基因相关的miRNAs。采用qRT-PCR对其中2个miRNAs进行验证，证实其表达趋势与测序结果一致。本研究筛选了GV期和MⅡ期卵母细胞差异表达miRNAs，推测差异表达的miRNAs可能通过代谢、卵母细胞减数分裂相关通路、孕激素介导的卵母细胞成熟通路等途径在卵母细胞体外成熟过程中发挥作用，并筛选出调控Npm2基因表达的miRNAs，研究结果可为进一步阐明miRNA对Npm2基因的调控及其在卵母细胞成熟过程中的作用提供依据。     

GMP玻璃化冷冻水牛GV期和MⅡ期卵母细胞

采用玻璃微细管法(Glass micropipette vitrification,GMP)冷冻了水牛GV期和MⅡ期卵母细胞。结果显示,GV期冻后卵母细胞的形态正常率,孤雌激活后的发育潜力均明显低于未冷冻组(P<0.05)。在进一步探讨不同发育阶段的水牛卵母细胞冷冻保存效果中发现,GV期卵母细胞的形态正常率,体外成熟后的孤雌激活分裂率和8-细胞率显著低于MⅡ期(P<0.05)。结果表明,水牛GV期卵母细胞冷冻的效果比MⅡ期差。     

水牛卵母细胞成熟前后的差异蛋白质组的分析

本试验以水牛卵母细胞为研究对象,通过基于双向电泳-质谱技术的蛋白质组学研究手段,鉴定卵母细胞成熟前后表达量存在变化的蛋白质并进行验证。通过优化方法建立水牛卵母细胞蛋白质双向电泳分离的技术体系,通过双向电泳(2-DE)获得成熟前后的卵母细胞蛋白质电泳图谱,软件分析得到差异表达蛋白质,对差异蛋白质进行飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)分析,部分差异蛋白质合成抗体进行Western blot验证。结果表明,2组卵母细胞样品均获得约300个蛋白质斑点的双向电泳图谱。经ImageMaster软件比对分析,共发现在水牛卵母细胞成熟前后有27个差异蛋白质,其中表达上调15个,表达下调12个。将差异蛋白质斑点胶内酶解后用于MALDITOF/TOF飞行时间质谱鉴定,成功鉴定了6个蛋白质,包括主要穹窿蛋白(MVP)、热激蛋白60(HSP60)、Ras应答结合原件蛋白1(RREB1)等。Western blot结果表明,HSP60蛋白表达与双向电泳结果一致。本试验发现一批在卵母细胞成熟前后的差异表达蛋白质并进行表达量验证,推测HSP60蛋白可能在体外成熟时起到保护卵母细胞和物质转运的作用。     

水牛卵母细胞GV/MⅡ期对应卵丘细胞miRNA差异表达分析

本研究旨在建立水牛卵母细胞体外成熟培养前后GV/MⅡ(Germinal vesicle,GV)/(MetaphaseⅡ,MⅡ)期对应的卵丘细胞miRNA数据库,筛选两个时期差异表达的miRNAs,为进一步阐明miRNA通过调控卵丘细胞中基因表达进而在卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用提供科学依据。分别收集水牛GV/MⅡ期的卵丘细胞,提取总RNA,利用Solexa测序技术获取小RNA测序数据,并进行生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了GV/MⅡ期卵丘细胞miRNA的表达谱,发现相对于GV期卵丘细胞,miRNA在MⅡ期卵丘细胞中表达差异显著上调的有24个,表达差异显著下调的有45个。采用qRT-PCR技术对随机筛选的8个miRNAs进行验证,证实其表达水平和RNA-seq分析结果相一致。结合靶基因预测和KEGG富集分析,获得了276条显著富集的信号通路;同时对富集前20的信号通路进行归纳总结,推测差异表达的miRNAs主要是通过细胞增殖、凋亡,物质代谢,细胞连接等途径在卵丘细胞中发挥作用。     

水牛卵泡液差异蛋白质双向电泳方法的建立及质谱分析

旨在研究沼泽型水牛成熟前后卵泡内差异表达蛋白质的变化规律。采用双向凝胶电泳技术分离成熟卵泡液和未成熟卵泡液总蛋白质,建立和优化了卵泡液的双向电泳体系,并使用质谱鉴定差异表达蛋白点。结果显示,丙酮沉淀法处理得到的总蛋白质样品后,在24cm(pH 4～7)胶条且上样量350μg时得到分辨率较好的双向电泳图谱。软件分析得到11个差异蛋白点,以成熟卵泡液作为对照,5个蛋白点表达上调,3个蛋白点表达下调,1个蛋白点缺失,2个蛋白点在未成熟卵泡液中特异性表达。质谱成功鉴定出4个蛋白质:过氧化物酶-2、醛糖还原酶、牛纤维蛋白原的晶体结构、转甲状腺素蛋白。该研究建立了良好的卵泡液双向电泳体系,分析并鉴定一批水牛卵泡液差异蛋白质,对于研究水牛卵母细胞的发育微环境和成熟机制提供了新的研究线索。     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活可帮助人们间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,且卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。本试验比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27h或30h的囊胚发育率（19.0%or 17.7%）明显高于体外成熟21h或24h的囊胚发育率（12.3%or 13.8%）;Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚（13.0%vs.21.7%）。     

玻璃化冷冻牛GV卵母细胞全基因组甲基化模式初探

旨在研究玻璃化冷冻对牛GV期卵母细胞全基因组甲基化的影响。本研究收集新鲜、玻璃化冷冻的牛GV卵母细胞,采用单细胞全基因组甲基化测序(ScWGBS)技术对新鲜、玻璃化法冷冻牛GV卵母细胞的全基因组甲基化水平进行检测,旨在揭示两者DNA甲基化模式的差异。结果表明,玻璃化冷冻不会对牛GV卵母细胞的全基因甲基化水平造成显著影响。基于基因本体(GO)和信号通路(KEGG)对140个差异甲基化区域(DMRs)进行分析,发现DMRs主要参与细胞发育、细胞骨架组织等功能,主要富集在PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路等,并筛选出与卵母细胞成熟(TSC2)、细胞骨架(NUDC)、细胞活力(MAFK)等相关的基因。上述结果,可为提高GV卵母细胞玻璃化冷冻效率奠定信息基础和研究方向。     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响

本研究以GV期和MII期卵母细胞作为试验材料,通过透射电镜方法观察卵母细胞冷冻前后的超微结构变化,结果发现,透射电镜下观察卵母细胞发现,GV期卵母细胞与透明带连接紧密,微绒毛伸入透明带中,皮质区分布大量的线粒体。脂滴分为两种,一种为灰色脂滴,一种为深色脂滴。MII期卵母细胞排出第一极体,质膜下分布大量的皮质颗粒。微绒毛缩短成矮柱状,线粒体常聚集存在,卵周隙出现。冻后GV期卵母细胞微绒毛消失,线粒体肿胀,线粒体内有囊泡样结构,包围脂滴的内质网不完整,胞质内溶解为絮状,未见高尔基体。冻后MII期卵母细胞透明带损伤、微绒毛、细胞膜损伤甚至消失、极少量皮质颗粒分布于皮质区。脂滴部分溶解,相互连接,脂滴周围伴随大量肿胀呈圆形的线粒体,嵴不明显,内呈囊泡样,未见到高尔基复合体结构。     

玻璃化冷冻牛GV卵母细胞全基因组甲基化模式初探

旨在研究玻璃化冷冻对牛GV期卵母细胞全基因组甲基化的影响。本研究收集新鲜、玻璃化冷冻的牛GV卵母细胞，采用单细胞全基因组甲基化测序（ScWGBS）技术对新鲜、玻璃化法冷冻牛GV卵母细胞的全基因组甲基化水平进行检测，旨在揭示两者DNA甲基化模式的差异。结果表明，玻璃化冷冻不会对牛GV卵母细胞的全基因甲基化水平造成显著影响。基于基因本体（GO）和信号通路（KEGG）对140个差异甲基化区域（DMRs）进行分析，发现DMRs主要参与细胞发育、细胞骨架组织等功能，主要富集在PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路等，并筛选出与卵母细胞成熟（TSC2）、细胞骨架（NUDC）、细胞活力（MAFK）等相关的基因。上述结果，可为提高GV卵母细胞玻璃化冷冻效率奠定信息基础和研究方向。     

细胞周期检查点激酶1的表达对猪卵母细胞体外成熟的影响

细胞周期检查点激酶1(Chk1)作为DNA复制检查点和DNA损伤反应的重要成员,在有丝分裂和减数分裂中都具有重要作用。为探究Chk1对猪卵母细胞减数分裂的影响,本研究首先采用免疫荧光染色和实时荧光定量PCR技术检测了Chk1在猪卵母细胞不同时期的表达和定位,随后利用chir-124抑制Chk1的表达,研究其对猪卵母细胞减数分裂的影响,以及相关基因的表达和纺锤体的变化。结果表明,Chk1在4个时期(GV、GVBD、MI、MII)均有表达,GV期主要定位在生发泡内,GVBD期主要定位在核周围,MI期和MII期主要定位在纺锤体上;用不同浓度的chir-124处理卵母细胞来抑制Chk1,发现0.5μmol/L的chir-124对卵母细胞生发泡破裂(GVBD)的影响最大,可显著提高猪卵母细胞处于GV-IV期的比例(P0.05),并且可显著提高卵母细胞达到GVBD期的比率(P0.05),但对后续的成熟没有显著影响;随后对MII期卵母细胞的基因表达进行检测发现,Chk1的抑制可调节cdk1、cdc25C、cyclin b1基因的表达,并使gwl基因的表达显著下降(P0.05),从而调节卵母细胞恢复减数分裂的进程;Chk1的表达会激活纺锤体组装检查点(SAC),阻止同源染色体分离,将猪卵母细胞定位在MI期,而减少Chk1的表达后,猪卵母细胞可渡过MI期,进入MII期。综上,在GV期使用chir-124抑制Chk1的表达可促进猪卵母细胞恢复减数分裂,并促进后续的成熟。     

猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果比较研究

为比较猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果,试验在这两个成熟阶段对其进行玻璃化冷冻,GV期卵母细胞解冻后培养至成熟,MⅡ期卵母细胞解冻后恢复2 h,然后采用免疫荧光标记、Western blotting和链霉蛋白酶溶解方法分别检测它们的皮质颗粒分布、CD9蛋白表达水平和透明带消化时间上的差异。结果表明,GV期卵母细胞在解冻后2 h的存活率显著低于MⅡ期卵母细胞（P<0.05）,但极体排出率与对照卵母细胞无明显差异（P>0.05）;在冷冻MⅡ期卵母细胞中,皮质颗粒的皮质区分布比例和CD9的蛋白表达水平显著下降（P<0.05）,但冷冻GV期卵母细胞经体外成熟后则无明显变化（P>0.05）;冷冻GV期与MⅡ期卵母细胞均不会影响透明带的消化时间（P>0.05）。由此可见,猪卵母细胞在GV期的冷冻存活率虽然较MⅡ期低,但其体外成熟后极体排出率、皮质颗粒分布和CD9蛋白表达水平均未受到冷冻的影响。     

封闭式拉长细管冷冻牛卵母细胞的研究

为探索封闭式拉长细管(closed pulled straw,CPS)冷冻牛卵母细胞的效果,将牛卵母细胞分别采用细管、开放式拉长细管(open pulledstraw,OPS)和CPS 3种方法进行冷冻,解冻后进行体外成熟、体外受精和胚胎体外培养。采用CPS法分别对GV期和成熟(MII期)牛卵母细胞进行冷冻保存,解冻后将卵母细胞培养至成熟,进行体外受精和胚胎体外培养。结果显示:OPS组和CPS组卵母细胞的正常形态率分别为83.1%和77.8%,成熟率分别为66.9%和64.4%,卵裂率分别为45.8%和43.4%,囊胚率分别为6.6%和6.0%,组间上述指标差异均不显著(P>0.05);但OPS和CPS组上述4项指标均显著高于细管冷冻组(P<0.05)。解冻后GV期和MII期卵母细胞卵裂率分别为44.5%和57.3%,囊胚率分别为6.8%和17.9%,组间卵裂率和囊胚率差异均显著(P<0.05)。结果表明:CPS法既具有OPS法快速降温的优点,同时,还能避免卵母细胞和液氮直接接触,降低卵母细胞通过液氮被污染的风险。因此,CPS冷冻法可以用于牛卵母细胞的冷冻。     

G蛋白偶联受体50在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与亚细胞定位研究

试验旨在研究G蛋白偶联受体50（G protein-coupled receptor 50,GPR50）在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与定位规律,为进一步解析卵母细胞成熟的分子机制及理解牦牛繁殖的特异性提供依据。通过牦牛卵母细胞体外成熟培养,利用免疫荧光染色监测不同时间点（0~24 h）纺锤丝形态和核相的变化,确定牦牛卵母细胞减数分裂4个时期,包括生发泡期（germinal vesicle,GV）、生发泡破裂期（germinal vesicle break down,GVBD）、第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ,MⅠ）与第二次减数分裂中期（metaphase Ⅱ,MⅡ）的时间点。在此基础上,通过实时荧光定量PCR检测GPR50基因在牦牛卵母细胞成熟过程中的动态表达量,免疫荧光染色检测GPR50蛋白在卵母细胞成熟过程中的的亚细胞动态定位情况。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟0 h时90%处于GV期,6 h时94%处于GVBD期,16 h时92%细胞处于MⅠ期,24 h时94%处于MⅡ期。实时荧光定量PCR结果表明,GPR50基因在牦牛卵母细胞GV期即有表达,并在GVBD、MⅠ、MⅡ期成熟过程中逐渐升高,在MⅡ期达到顶峰,且极显著高于GV与GVBD期（P<0.01）。GPR50蛋白在牦牛卵母细胞GV期时集中在膜上表达,并随着成熟进程的发展在细胞质和细胞膜均大量表达,在MⅡ期高亮度弥散表达。以上结果表明,GPR50基因参与牦牛卵母细胞减数分裂过程并发挥重要作用,为研究GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的作用及机制提供了依据。     

山羊卵母细胞体外培养体系及冻存后体外培养的研究

随着哺乳动物胚胎工程技术的深入研究和商业化胚胎移植技术的快速发展,对卵母细胞的需求量急剧增加。而冷冻的卵母细胞可为胚胎工程技术研究提供方便、丰富的材料来源。试验以屠宰场云岭黑山羊卵巢卵母细胞为实验材料,研究冷冻后的山羊卵母细胞体外培养体系。结果表明,采用传统成熟培养液（OM＋10%FBS）与在其中添加1%ITS（OM＋10%FBS＋1%ITS）对卵母细胞培养成熟率无显著差异（71.6%vs 76.2%）,而孤雌激活的卵裂率差异显著（60.5%vs 71.5%）。用优化的卵母细胞成熟体系培养解冻后的GV期COCs,成熟率31.5%;用添加有ITS和EGF的胚胎培养液培养解冻后GV和MII期孤雌激活的卵母细胞,其卵裂率分别为35.6%、58.4%,差异极显著（P〈0.01）。     

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

牛体外成熟卵母细胞染色体形态学研究

[目的]为了给牛体细胞克隆和转基因克隆工作提供基础性材料.[方法]在显微镜下,从卵液中捡出卵丘-卵母细胞复合体,置入成熟培养液中进行成熟培养,处理培养不同时期的卵母细胞,所得的去掉卵丘的卵母细胞固定在载玻片上,染色、冲洗、晾干,在显微镜下观察.[结果]表明:成熟培养0 h到4 h大多数卵母细胞处于GV期(97.5%～87.8%),培养6 h以后GVBD发生了卵母细胞数量明显增多(51.6%),成熟培养8 h～12 h处于Pre-MI的卵母细胞逐渐减少(76.7%～43.2%),MI期卵母细胞逐渐增多(13.3%～50.0%).成熟培养16 h有17.8%的卵母细胞处于MII期,大部分细胞仍处于MI期(40.0%)和AI/TI期(42.2%).从16 h～24 h,MII期卵逐渐增多,培养24 h后大多数卵母细胞排出第一极体到达MII期(86.5%).[结论]在减数分裂过程中,染色体也发生了显著的形态变化.第一次减数分裂中期时的染色体清晰可数,进入后期时,分开的两团染色体各自凝集成染色质团,并且一直持续到末期,到达第二次减数分裂中期时又成为清晰可数的染色体状态.     

甲基-β-环糊精载胆固醇对GV期猪卵母细胞冻融后体外成熟及其受精能力的影响

本实验旨在探究甲基-β-环糊精载胆固醇(CLC)对GV期猪卵母细胞冻融后体外成熟培养后成熟率、凋亡蛋白表达、透明带硬化时间及精-卵结合能力的影响。采用0(对照)、0.5、5、10 mg/mL CLC进行处理,共4组,采用Western blot方法分析GV期猪卵母细胞冻融体外成熟培养后凋亡蛋白的表达量。通过Hoechst染色方法检测不同组别的精卵结合能力。结果表明:5 mg/mL CLC处理组GV期冻融的猪卵母细胞体外成熟率高于对照组和0.5 mg/mL CLC处理组(P<0.05),但与10 mg/mL CLC处理组相比差异不显著;与对照组和0.5 mg/mL处理组相比,5 mg/mL CLC处理组显著降低了GV期冻融的猪卵母细胞体外成熟培养后Cleaved Caspase-3蛋白表达量(P<0.05),但与10 mg/mL CLC处理组差异不显著;与对照组和0.5、10 mg/mL CLC处理组相比,5 mg/mL CLC处理组减少了GV期冻融的猪卵母细胞体外成熟培养后透明带硬化时间(P<0.05);与对照组和0.5、10 mg/mL处理组相比,5 mg/mL CLC处理组提高了GV期冻融的猪卵母细胞体外成熟培养后精-卵结合能力(P<0.05)。综上表明,在玻璃化冷冻液中添加5 mg/mL CLC可显著减少GV期猪卵母细胞在冷冻保存过程中受到的低温损伤。     

卵母细胞ZP蛋白及其泛素化的研究进展

卵透明带(ZP)是包围在卵母细胞外的糖蛋白基质,在受精过程中的精卵识别及顶体反应中都起着十分重要作用。研究证实,泛素化蛋白质存在于哺乳动物的ZP上,而泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白降解又是机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个重要机制。因此,在受精过程中,精子顶体和成熟卵母细胞释放蛋白酶体,有可能通过泛素-蛋白酶体途径降解ZP中的泛素化蛋白。文章主要对卵母细胞ZP的结构和功能及泛素-蛋白酶体途径参与受精过程作一综述。