Ghrelin在驯鹿胃肠道的表达及定位检测

通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学技术对Ghrelin在驯鹿胃肠道的表达及定位进行初步研究。RT-qPCR结果显示,Ghrelin在驯鹿胃肠道内均有表达,且在皱胃内表达量极显著高于其他组织(P0.01),其次是十二指肠、回肠和结肠;免疫组织化学结果显示,Ghrelin免疫阳性细胞在皱胃内主要分布于黏膜层、黏膜下层和肌层;在瘤胃、网胃、瓣胃的黏膜层、黏膜下层中也可见Ghrelin的免疫阳性细胞,但肌层中未见表达;在十二指肠、空肠、回肠、结肠的黏膜层、黏膜下层和肌层均有Ghrelin免疫阳性细胞分布,且在肠绒毛和黏膜下层分布较多。RT-qPCR和免疫组织化学结果显示,Ghrelin在胃肠道内表达量及分布范围基本一致,这表明Ghrelin对驯鹿的消化可能具有潜在的调控作用。     

Ghrelin在马鹿器官组织中的表达

为研究Ghrelin在马鹿体内可能表达的器官,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法检测马鹿的舌、食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肝、胰、颌下腺、腮腺、气管、肺、肾、输尿管、膀胱、卵巢、输卵管、子宫、阴道、大脑、下丘脑、垂体、松果体、甲状腺、肾上腺、心肌、心内膜、脾、淋巴结和骨骼肌中Ghrelin表达情况。结果显示,Ghrelin在皱胃内的表达量明显高于其他器官(P0.05);胰、子宫、卵巢、十二指肠和食管次之,与其余30种器官的表达量相比差异也显著(P0.05);其余器官内的表达量相对较少。结论:Ghrelin在所检测的36种器官内均有表达。     

驯鹿生长素Ghrelin cDNA的克隆

从驯鹿皱胃组织中提取总RNA,根据已发表的驯鹿生长素Ghrelin基因序列设计并合成引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得了300 bp的片段,重组到pBlueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定分析,确认PCR产物为Ghrelin cDNA,为进一步研究Chrelin在驯鹿体内的分布及营养因素等对其基因表达的影响奠定基础。     

驯鹿β-防御素-1(reBD-1)mRNA在驯鹿组织器官中的表达检测

为了检测reBD-1 mRNA在驯鹿体内可能的表达器官,研究根据已知的reBD-1 cDNA序列设计了一对预计扩增产物为121 bp的引物,以驯鹿舌、食管、瘤胃、网胃、皱胃、十二指肠、回肠、结肠、肝、肺、气管、肾、膀胱、睾丸、附睾、心脏、脾脏中提取的总RNA为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)技术检测驯鹿的上述器官内reBD-1 mRNA的表达情况.结果显示:reBD-1 mRNA在上述组织器官中均有表达,其中在舌、瘤胃、睾丸中表达最强;在食管、十二指肠、结肠、气管、脾脏中有中等量的表达;在网胃、皱胃、回肠、肝、肺、肾、膀胱、附睾、心脏内的表达较弱.β-防御素reBD-1在驯鹿体内的广泛表达提示reBD-1有助于驯鹿的先天性宿主防御.     

驯鹿Ghrelin基因组DNA克隆及序列分析

为了得到驯鹿Ghrelin基因组DNA的全序列,试验根据驯鹿Ghrelin DNA外显子1~4序列设计特异性引物,利用PCR技术对驯鹿的Ghrelin基因进行扩增,经基因组染色体步移和克隆技术获得Ghrelin基因组DNA全序列,并分析其序列结构特点。结果表明:成功克隆出全长为4 076 bp的驯鹿Ghrelin基因组DNA全序列(GenBank accession No.KX857495),其由4个外显子和3个内含子构成,4个外显子片段大小分别为154,114,109,148 bp,3个内含子片段大小分别为198,2 868,485 bp。     

RT-PCR技术检测绵羊卵巢内Ghrelin的表达

为了明确Ghrelin在绵羊卵巢有腔卵泡上是否存在表达,本研究利用实时定量RT-PCR技术检测了绵羊卵巢有腔卵泡内的卵母细胞、卵丘细胞和壁层颗粒细胞的Ghrelin蛋白的表达量情况。结果揭示绵羊卵巢有腔卵泡内各类型细胞Ghrelin mRNA的相对表达量大致相同。绵羊卵巢有腔卵泡内各类型细胞Ghrelin蛋白的表达及Ghrelin mRNA的表达模式,尤其是卵母细胞中的表达,揭示这一新型分子在绵羊卵巢上具有潜在的调控作用。     

Ghrelin在成年皖西白鹅小肠内的免疫组化定位研究

采用免疫组化SABC法并结合DAB显色技术研究了皖西白鹅小肠内Ghrelin阳性细胞及其分布。结果：①Ghrelin免疫阳性细胞主要位于小肠的黏膜层，而黏膜下层和肌层未见Ghrelin阳性细胞。这些阳性细胞，胞浆着色，主要有两类，一类为“闭合型”细胞，呈圆形或椭圆形，其顶部不露于腔面，另一类为“开放型”细胞，呈锥体型，细胞顶部达到腔面。②在十二指肠，“开放型”和“闭合型”两种阳性细胞均可观察到，而在空肠和回肠，主要为“闭合型”阳性细胞。产生Ghrelin的细胞在成年皖西白鹅小肠黏膜层有广泛的分布，揭示Ghrelin可能调节小肠的功能。     

Ghrelin免疫反应阳性细胞在鸡外周器官中的定位分布与发育性变化

本试验应用免疫组织化学方法和显微图像分析技术,研究了2、16、30、44、58日龄岭南黄鸡外周器官中Ghrelin免疫反应阳性细胞的定位分布与发育性变化。结果表明,在鸡腺胃、肠、心、肝、脾、肺、肾、胰、脑垂体、肾上腺、胸腺、法氏囊中均可观察到Ghrelin免疫阳性反应。其阳性细胞类型包括:腺胃腺小管的内分泌细胞,肠道黏膜上皮和肠腺内的内分泌细胞,肠道黏膜下层和肌层间的神经丛,心内膜下层的蒲肯野纤维,肝血窦中的枯否氏细胞,脾的巨噬细胞和网状细胞,肺的巨噬细胞,肾脏肾小囊壁层的扁平上皮细胞和脏层的足细胞、球内系膜细胞和球旁复合体,胰腺的胰岛细胞,腺垂体的部分嗜酸性细胞和嗜碱性细胞,肾上腺的嗜铬细胞,胸腺上皮细胞、胸腺小体和巨噬细胞,法氏囊黏膜上皮和小结相关上皮内的内分泌细胞、囊小结的网状细胞、巨噬细胞、皮质髓质交界处的上皮细胞等。2~30日龄鸡,随着日龄的增长,各器官中的Ghrelin表达量增加,44、58日龄则有所下降。     

Ghrelin在成年皖西白鹅大、小脑内的免疫组化定位

采用免疫组化技术链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(StreptAvidin-Biotin-Complex,SABC)法,对成年皖西白鹅大脑和小脑中ghrelin神经元的定位和分布进行了研究。结果显示,大脑分泌ghrelin的神经元和神经纤维主要分布在大脑皮质内,其中锥体层阳性神经元数量最多,多为锥体细胞;小脑分泌ghrelin的神经元主要分布在小脑皮质内,其中蒲肯野细胞层和分子层免疫阳性神经元数量最多,颗粒层阳性神经元数量较少;而大脑和小脑白质内均未见分布。这表明ghrelin在成年皖西白鹅大脑和小脑皮质中分布广泛,可能以自分泌/旁分泌的形式调节中枢神经系统。     

Ghrelin免疫阳性细胞在白来航鸡胸腺内的分布与定位

Ghrelin最初是从哺乳动物胃组织中分离出来的一种具有28个氨基酸残基的生长激素促泌素受体的内源性配体[1]。随后,在脊椎动物的其它类群如鱼、牛蛙和鸡等动物中也分离出Ghrelin。尽管Ghrelin主要是胃肠道的产物,但在包括免疫器官在内的外周器官如胰腺、胎盘、肺、心脏、肾脏、甲状腺等均有表达[2],具有调节垂体分泌生长激素,调节食欲、能量平衡、胃肠功能、生殖功能和心血管功能等广泛的生物学功能。同时,在T、B     

驯鹿主要周围免疫器官的组织学研究

应用HE染色法对驯鹿主要周围免疫器官－－脾及淋巴结作组织学观察，脾脏表面覆盖有浆膜，浆膜下是一层较厚的致密的结缔组织，构成被膜，被膜与实质内的脾小梁相连，实质由白髓和红髓两部分组成，白髓和红髓是相间排列，二之间的分界不明显，白髓主要由脾小结构成，脾小结由中型淋巴细胞组成，且有生发中心，脾小结中有1－2条有2－3个皱襞的中央动脉，偏于脾小结的一侧有动脉周围淋巴鞘，在白髓的外周有边缘区，边缘区内有1－2个鞘动脉。红髓由脾索和脾窦组成，脾索成索状，由网状细胞及中，小型淋巴细胞组成，脾窦不规则，其内皮细胞扁平状，核呈长梭形，脾窦内可见大量的红细胞存在。淋巴结是由被膜，实质中的皮质和髓质构成，淋巴结表面覆有薄层结缔组织被膜，皮质由淋巴小结，皮质淋已窦和副皮质区构成，髓质由髓索和髓窦构成。     

Ghrelin在梅花鹿体内的免疫组化定位研究

为了阐明胃饥饿素(Ghrelin)在梅花鹿体内的表达规律,采用免疫组织化学方法检测Ghrelin在梅花鹿食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、肝、胰、甲状腺、垂体前叶、卵巢、肺、肾和脾等组织中的分布规律。结果显示:Ghrelin免疫阳性细胞在食管和皱胃内主要分布于黏膜层、黏膜下层和肌层;在网胃、瓣胃和瘤胃的黏膜层及黏膜下层中均可见Ghrelin免疫阳性细胞,但肌层中未见表达;在肠道主要定位于黏膜层、黏膜下层和肌层,尤其在肠绒毛和黏膜下层分布较多;在肝、胰、甲状腺、垂体前叶、卵巢、肺、肾、脾等实质器官中同样发现有Ghrelin免疫阳性信号的表达。结果提示,Ghrelin在梅花鹿体内广泛表达且在食管和胃肠道内分布范围最广。     

Ghrelin及其受体在兔淋巴器官的分布及发育性变化

利用免疫组化法研究Ghrelin在3月龄新西兰大白兔免疫器官内的分布定位。结果显示:Ghrelin免疫阳性细胞分布于脾、胸腺和腘淋巴结,以脾中的分布密度为最高。利用RT-PCR方法研究Ghrelin及其受体在1,3,6和12月龄兔免疫器官内的发育性变化。PCR结果显示:Ghren-lin及其受体mRNA在兔脾、胸腺和腘淋巴结均表达,Ghrenlin mRNA在腘淋巴结的表达水平较高,在脾脏和胸腺的表达较低;3种器官内Ghren-lin基因表达的发育变化趋势一致,以1月龄和3月龄表达较高,6月龄和12月龄较低。Ghrenlin受体mRNA的表达以胸腺为最高,在其他2种器官内的表达基本相似;胸腺内Ghrenlin受体基因表达的发育变化趋势与Ghrenlin基因表达的趋势一致,但在其他2种器官内的发育性变化则相反,以12月龄和6月龄较高。这表明Ghrelin及其受体在兔免疫器官内呈发育性变化。     

猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

Ghrelin在BALB/c小鼠胸腺中的定位分布与发育性表达

本试验应用免疫组织化学方法和显微图像分析技术,探讨了Ghrelin在1、3、5、6、12月龄BALB/c小鼠胸腺中的定位分布和发育性表达规律。结果表明,Ghrelin免疫阳性反应主要分布于胸腺髓质内,而胸腺皮质中较少。Ghrelin阳性细胞类型包括被膜下胸腺上皮细胞、星形胸腺上皮细胞、髓质胸腺上皮细胞、胸腺小体上皮细胞、巨噬细胞、胸腺髓质的部分淋巴细胞,可能还有胸腺树突状细胞。Ghrelin在小鼠胸腺中的表达量,1、3月龄之间差异不显著(P0.05),5、6月龄之间差异也不显著(P0.05),但5、6月龄显著低于1、3月龄(P0.05),而12月龄又显著低于5、6月龄(P0.05)和极显著低于1、3月龄(P0.01),即随着年龄的增长,胸腺中的Ghrelin表达量逐渐减少。结果提示,胸腺的年龄性退化可能与Ghrelin的表达量下降有关。     

挪威驯鹿瘤胃内微生物的利用

绵羊等反刍动物以草为食,靠瘤胃内纤毛虫和细菌等微生物作用,把粗纤维降解成可被机体利用的形式,可是对含粗纤维特别是木质素多、坚韧干硬的秸秆饲料以及地衣等的利用率很低。而挪威驯鹿则不同,它可长期以此为生,生长健壮。驯鹿瘤胃内的微生物比较特殊,其分解利用     

山羊Lcn5的表达特点及其在繁殖器官中定位

为探明附睾视黄酸结合蛋白5(Lcn 5)mRNA在公山羊体组织及不同月龄附睾中的表达特性,及其在睾丸、附睾和精子中的定位。采用实时荧光定量PCR方法检测18种组织和不同月龄附睾Lcn5mRNA表达规律;利用蛋白印迹技术对成年公羊睾丸和附睾Lcn 5蛋白表达进行定量分析;利用免疫组化技术对5月龄公羊睾丸和附睾Lcn 5进行定位,利用免疫荧光技术对精子Lcn 5进行定位。Lcn5mRNA在不同组织中均有表达,其中在性腺中的表达量最高,附睾头附睾尾附睾体睾丸;在5月龄前附睾的Lcn5mRNA表达量随月龄逐渐升高,5月龄时达到最高,随后又逐渐降低。Western blotting结果显示,Lcn 5蛋白表达量:附睾头附睾尾附睾体睾丸,支持了Lcn5mRNA定量的结果。免疫组化结果显示,5月龄山羊在附睾管壁的柱状细胞、纤毛细胞检测到较强Lcn 5蛋白表达的阳性信号,附睾尾管腔检测到较强的阳性信号。在睾丸各级生精细胞中也检测到了微弱阳性信号。Lcn 5蛋白包裹在精子头部顶体帽上。Lcn5在山羊附睾中高度表达,其表达具有时空特异性,推测其在精子成熟和维持正常生理功能方面发挥重要作用,其生物学功能需要进一步深入研究。     

雏鸡免疫器官中chMDA5的表达与定位

为研究鸡模式识别受体MDA5(chMDA5)在雏鸡免疫器官中的表达与定位,分别于1、7、14、21、28、31、35、42、45、49日龄时从50只健康海兰白蛋鸡中随机选取5只,采取法氏囊、胸腺及脾,应用实时荧光定量PCR、Western blot及间接免疫荧光技术检测雏鸡免疫器官中chMDA5的表达情况。结果发现,在各日龄雏鸡法氏囊、胸腺及脾内均检测到chMDA5转录;在法氏囊淋巴滤泡的皮质、胸腺小叶的皮质和髓质及脾的白髓和红髓部位均检测到chMDA5阳性细胞;法氏囊和胸腺组织中chMDA5蛋白的表达规律较为一致,即在1~7日龄呈上升趋势并在7日龄达到峰值,随后下调,在14~35日龄时呈波动变化,之后逐渐上调并趋于稳定;脾中chMDA5蛋白表达以14d左右为一个周期变化,随着日龄增大其表达量在总体上趋于上调。结果表明,chMDA5在雏鸡免疫器官中均有表达,且不同日龄之间的表达存在差异。本研究为进一步探究chMDA5与雏鸡免疫功能相关性提供了科学的试验依据。     

雏鸡免疫器官中chTLRLR4的表达与定位

为研究鸡Toll样受体4(chTLR4)在雏鸡免疫器官(法氏囊、胸腺、脾脏)中的表达与定位,将50只健康海兰白蛋鸡随机分成10组,每组5只,分别于1、7、14、21、28、31、35、42、45、49日龄时随机扑杀一组,取法氏囊、胸腺及脾脏,应用实时荧光定量PCR、Western blot及间接免疫荧光方法检测雏鸡免疫器官中chTLR4的表达情况。结果:1在各日龄雏鸡法氏囊、胸腺及脾脏内均检测到chTLR4转录及chTLR4蛋白的表达。2法氏囊淋巴滤泡的皮质和髓质内均可见免疫阳性细胞,尤其是在髓质部免疫阳性反应较强;胸腺小叶的皮质、髓质及脾脏的红髓和白髓细胞内均可观察到免疫阳性反应区。3法氏囊中chTLR4蛋白表达在1~42日龄均处于较高水平并存在小幅波动,42~49日龄表达量逐渐下降;各日龄雏鸡胸腺、脾脏中chTLR4蛋白表达趋势相似,1~14日龄表达量逐渐升高,14~35日龄呈波动变化,35~42日龄呈下降趋势。研究表明,在各日龄雏鸡免疫器官中均有chTLR4表达,且存在差异。研究结果为进一步探究chTLR4与雏鸡免疫功能相关性提供了依据。     

驯鹿的饲养及繁殖

驯鹿（Kangifertarandus）属偶蹄目．鹿科．是产于北极和近北极地区的动物。在我国驯鹿主要栖息于大兴安岭西北坡的密林里．活动范围在东经120°15’～123°35’．北纬51°15’～53°15’的地区．具有很强的耐寒性．驯鹿的经济价值很高．其茸、皮、肉、乳均可利用、同时又因其长相奇特、十分驯良．在动物园中具有较高的观赏价值。驯鹿在哈尔滨动物园已有近20年的饲养历史．以前由于各种原因饲养繁殖效果不理想。自1995年以来．对其饲养繁殖．采用科学的管理方法．取得了显著成效。1995～1998年间共繁殖驯鹿11只．具有繁殖能力的成年母鹿繁…