单核细胞增生李斯特菌溶血素hly基因缺失株和回补株的构建

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰染色阳性菌,在人类与动物生活环境中均广泛分布,为人畜共患病原菌。李斯特菌溶血素O(LLO,由hly编码)作为李斯特菌重要毒力因子主要在细菌裂解并逃逸吞噬体中起作用,但其潜在的分子机制尚待深入解析。以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,通过PCR分别扩增hly基因的上、下游同源臂序列(各约500bp),选用SOE PCR方法将同源臂整合连接成融合片段。经BamHⅠ/SalⅠ酶切、连接后克隆至李斯特菌温敏型穿梭质粒pKSV7中得到重组质粒pSL081,测序验证后电转至EGD-e感受态细胞中,在温度变化及抗生素双重选择压力下筛选获得hly基因缺失株Δhly。同时,设计引物扩增含hly基因启动子和编码区序列的片段,克隆至李斯特菌整合型质粒pIMK2中得到重组质粒pSL251,测序验证后电转至缺失株Δhly感受态细胞中,经抗性筛选获得回补株CΔhly。测序结果显示,缺失株Δhly和回补株CΔhly均构建正确。利用Western blot方法检测突变株中LLO的表达情况,结果显示EGD-e和CΔhly中均能检测到LLO的正常表达,而Δhly中无法检测到,进一步证实成功构建了hly基因缺失株和回补株,为下一步深入探索LLO在李斯特菌感染过程中的生物学功能奠定了基础。     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...     

单增李斯特菌hly基因缺失株的构建及重要特性分析

为构建单增李斯特菌(LM)hly基因缺失株,并分析其生物学特性和免疫保护效果,本研究利用同源重组技术获得基因缺失株LM△hly112-153,研究该缺失株对巨噬细胞的侵袭力、溶血能力并测定其LD50,同时评价该缺失株对小鼠的免疫保护效果。结果显示经PCR扩增及序列分析表明获得基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对巨噬细胞的侵袭能力显著下降(p<0.01);其溶血活性比野生株降低2个滴度;并且该缺失株对BALB/c小鼠的LD50为4.253×108 cfu,高于野生株3个数量级;免疫保护试验显示,经缺失株免疫的小鼠对野生株攻毒有75%的免疫保护率。本研究构建了基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对小鼠具有较好的免疫保护效果,以上研究为减毒李斯特菌疫苗载体的研发奠定重要基础。     

溶血素基因缺失对单增李斯特菌在小鼠肠道内定殖的影响

旨在探究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)溶血素hly、llsB基因对小鼠肠道的影响。在构建Lm的hly基因缺失株基础上,以Lm90SB2及溶血素基因缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB为试验菌,进行生长曲线、溶血活性以及器官载菌量的测定。结果：缺失株在不同条件下的生长特性与亲本株相比无明显差异;Lm90SB2、Lm90SB2-ΔllsB的溶血效价分别为1log2、2log2,而Lm90SB2-Δhly基本无溶血现象。缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB的肠道载菌量均低于亲本株Lm90SB2(P<0.05),在各个时间点肠道中的细菌定殖率依次为Lm90SB2>Lm90SB2-Δhly>Lm90SB2-ΔllsB。本研究表明,hly、llsB基因对Lm在小鼠肠道内定殖可能有直接或间接的调控作用,试验结果为进一步研究hly、llsB基因在Lm致病过程中的作用提供一定的理论依据。     

黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素的作用

为了研究黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素(LLO)溶血活性及单增李斯特菌致病力的影响,试验采用测定最小抑菌浓度(MIC)、绘制生长曲线、分析溶血活性、蛋白免疫印迹分析和细胞毒性试验的方法分析了黄芩提取物对单增李斯特菌增殖、单增李斯特菌溶血素溶血活性和单增李斯特菌对细胞的毒性作用。结果表明:黄芩提取物可通过直接中和单增李斯特菌溶血素活性而降低溶血活性,且这一作用与黄芩提取物的抗菌活性无关;在细菌与细胞共培养体系内加入黄芩提取物可有效抑制细菌对细胞介导的细胞毒性作用。说明黄芩提取物是一种潜在的抗单增李斯特菌感染的先导化合物。     

单增李斯特菌Lm4b＿02324基因缺失株的构建及生物特性研究

【目的】研究Lm4b＿02324基因编码的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶对单增李斯特菌生物学特性的影响,为研究单增李斯特菌的致病机制奠定基础。【方法】本研究使用重叠延伸PCR技术,并通过连续传代来构建稳定遗传野生型单增李斯特菌Lm928株的Lm4b＿02324基因缺失株(Lm928Δm4b＿02324)与Lm4b＿02324基因回补株(CLm928Δm4b＿02324)。通过检测不同培养时间的D_{600 nm}值并绘制生长曲线分析Lm928、Lm928ΔLm4b＿02324和CLm928ΔLm4b＿02324 3株菌的生长特性;对小鼠腹腔注射不同浓度的3株菌,观察感染后临床症状,统计死亡率,通过寇氏法计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD₅₀);将Lm928、Lm928ΔLm4b＿02324和CLm928ΔLm4b＿02324以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10分别感染HCMEC细胞,通过检测感染后不同时间细胞内的细菌数量分析各菌株的黏附与侵袭能力和胞内生存能力;提取野生株与缺失株DNA,使用prfA、mpl、h...     

单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究

为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。     

单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析内化素InlK对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性及致病性的影响,利用自杀性质粒进行同源重组构建LM标准菌株10403s的inlK基因缺失株,然后比较分析野生株、inlK基因缺失株的生长特性、生物被膜形成能力、细胞侵袭能力、动物致病力等差异。结果显示,inlK基因缺失不影响LM的生长速度,但可导致LM的生物被膜形成能力下降。细胞感染试验表明基因缺失株ΔinlK对RAW264.7细胞的侵袭及胞内存活能力分别下降了18%和31%。动物感染试验显示野生株和基因缺失株ΔinlK对小鼠的致死率分别为80%(4/5)和40%(2/5),且基因缺失株ΔinlK的体内定殖能力显著低于野生株。本研究表明内化素InlK在LM感染过程中发挥着重要作用,为了解LM的致病作用提供参考。     

单增李斯特菌溶血素LLS/LLO缺失株的构建及小鼠免疫保护性研究

旨在探究单增李斯特菌溶血素S/O(LLS/LLO)对单增李斯特菌(LM)的部分生物学特性影响及单增李斯特菌溶血素S/O基因缺失株的免疫原性。利用同源重组技术在本实验室已成功构建并保存的LM90SB2Δlls菌株基础上构建LM90SB2Δlls-Δllo,并绘制LM90SB2和LM90SB2Δlls-Δllo的生长曲线，测定半数致死量(LD₅₀)、组织载菌量(同时采用灌服和腹腔注射方式)等，进行小鼠免疫保护性研究，分析溶血素基因llsB/hly缺失对LM的生长特性以及毒力的影响。结果：成功构建LM90SB2Δlls-Δllo缺失株，且能在体外稳定遗传。测定生长曲线，LM90SB2的生长活性略高于LM90SB2Δlls-Δllo; LM90SB2的LD₅₀为3.65×10^7.23 CFU,LM90SB2Δlls-Δllo的LD₅₀大于2.7×10⁹ CFU;通过灌服及腹腔注射，与LM90SB2相比，LM90SB2Δlls-Δllo在小鼠脑、肝、脾中的载菌量均明显减少，差异极显著(P...     

单增李斯特标准菌NrdD基因插入突变株的构建

利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株,从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂,与pKSV7质粒相连,构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2,将其电转入单增李斯特菌后,用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突变株,并对突变菌株序列测定,证明回复突变株构建成功。该突变株可在严格无氧环境中生存,为进一步研究NrdD基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发奠定了基础。     

内化素A/B对单增李斯特菌在模拟酸性胃环境中耐受性的影响

单核细胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes,LM)是一种重要的食源性病原菌,它可以通过人口途径进入胃肠道,并穿越屏障进入肠道细胞中定殖并感染,由此可见该菌引起食物中毒的首要条件是抵抗人体内恶劣的酸性胃环境。本研究以单增李斯特菌LM90SB2及内化素基因缺失株LM90SB2ΔInlAB、LM90SB2ΔInlA、LM90SB2ΔInlB为受试菌,对4株菌进行生长曲线的测定,对其携带毒力基因溶血素(hly)扩增验证;不同pH条件下的生长曲线测定,以及模拟酸性胃环境中的耐受性研究。结果表明2～6 h 4株菌处于对数生长期,并均携带溶血素O的毒力基因hly,适宜生长的pH为6～7,pH=9时LM90SB2生长显著高于LM90SB2ΔInlAB(P0.05)。受试菌在模拟胃环境中的存活率与其pH及作用时间相关,当pH=3.5时,4株菌的存活率依次为LM90SB2LM90SB2ΔInlA LM90SB2ΔInlBLM90SB2ΔInlAB;当pH=2.5时LM90SB2生长极显著高于LM90SB2ΔInlAB(P0.01),且随着时间的推移,4株菌生长曲线均呈下降趋势;当pH=1.5时,LM90SB2在l h、2 h时分别有0.075%及0.03%的存活率,而缺失株的存活率为0。研究表明,内化素A/B在LM抵抗人体酸性胃环境中发挥重要作用。     

一株单核细胞增生李斯特菌分离株的分子分型鉴定及其生物学特性

从上海某羊养殖场获得了一株单核细胞增生李斯特菌分离株CMG47。为了确定该单核细胞增生李斯特菌分离株的分子分型,了解其生物学特性,本研究通过多重PCR对该菌株进行谱系和血清型分析,利用多位点序列分型(MLST)方法鉴定其分子分型。采用PCR方法对主要毒力基因进行检测,并通过体外观察和荧光定量PCR对菌株溶脂溶血特性进行分析。将菌株通过腹腔注射ICR小鼠和静脉注射斑马鱼,测定其毒力。研究结果表明该分离株属于谱系Ⅰ,1/2b血清型;序列分型为ST619;携带prfA、inlA、inlB、plcA、plcB、mpl、actA、hly等主要毒力因子;体外无明显溶脂活性,溶血活性较弱;小鼠和斑马鱼试验均显示,该分离株属于强毒株,与强毒参考株EGDe的毒力相当(P0.05)。该分离株的谱系/血清型为引起李斯特菌病的主要型别,拥有整套主要毒力因子,为单增李斯特菌强毒株。本研究为李斯特菌病散发病例的流行和传播特征分析提供了分子生物学基础,对建立健全李斯特菌监测体系和风险评估意义重大。     

细胞溶素HlyE变体对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究细胞溶素HlyE突变体(HlyE-V)对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病力的影响，采用Red同源重组法构建了APEC菌株CBE59的HlyE-V基因缺失株CBE59ΔHlyE-V和回补株CBE59CΔHlyE-V,测定缺失株生长曲线、溶血活性、胞内存活曲线，并用细胞毒性试验和动物试验来评估HlyE-V对APEC致病力的影响。结果表明∶缺失HlyE-V基因对APEC的生长速率影响较小，野生株、缺失株和回补株均无溶血活性，证明HlyE-V不是孔道形成毒素，不能溶解哺乳动物的红细胞；HlyE-V缺失株致细胞毒性和对雏鸡的致病力显著降低，缺失株的半数致死量(LD₅₀)值为4.9×10⁶CFU/只，而野生株和回补株的LD₅₀分别为8.2×10⁵CFU/只、4.2×10⁵CFU/只；在HD11巨噬细胞内的存活能力显著下降，在野生株CBE59感染的HD11中有一半的细胞中含有6～8个细菌，且有56.7%的细胞中观察到超过6个细菌；而在观察缺失株CBE59ΔHlyE-V时，菌量超过6个...     

糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响

为了探明糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响,本研究利用同源重组技术构建了galU基因缺失株,分析了亲本株ScottA、缺失株ΔgalU和回补株CΔgalU的生长能力、对细胞的黏附侵袭能力以及对小鼠的致病性。生长试验结果显示,galU基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。细胞侵染试验结果显示,ΔgalU对肠上皮细胞Caco-2的黏附率(0.74±0.18)%和侵袭率(0.70±0.10)%均显著低于亲本株ScottA的黏附率(2.01±0.11)%和侵袭率(2.48±0.25)%,回补株CΔgalU与亲本株的黏附侵袭率则并无显著性差异。免疫印迹结果显示,内化素InlB在ΔgalU细菌表面的锚定量显著低于亲本株,但其表面InlA的锚定量与亲本株并无显著性差异。小鼠试验结果显示,ΔgalU感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为(3.76×10~7±1.41×10~7)CFU/g和(2.88×10~7±2.31×10~7)CFU/g,均显著低于亲本株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量;此外,ΔgalU感染组小鼠的存活率高于亲本株,但与回补株感染组小鼠的存活率一致。上述结...     

单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

为分析单增李斯特菌溶血素S(listeriolysin S,LLS)llsB基因缺失对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性的影响,本研究利用同源重组构建了llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,并以8周龄、体重40g±5g的健康昆明系雄性小鼠为试验动物对其生长特性、半数致死量(LD50)、脏器载菌量等生物学特性进行了初步研究。结果显示,本研究成功构建了llsB基因缺失株;缺失株在体外连续培养20代过程中能稳定遗传。通过生长曲线测定发现,llsB基因缺失株生长活性略高于亲本株;小鼠感染试验结果显示,亲本株和缺失株的LD50分别为106.17和106.50 CFU;与亲本株相比,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均极显著减少(P0.01),说明缺失株对小鼠的感染能力明显减弱。在小鼠脑中未检出单增李斯特菌。综上所述,llsB基因对LM90的部分生物学特性可能有直接或间接的调控作用,本试验结果为进一步研究LLS的致病机理及防控李斯特菌病提供一定的理论依据。     

布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白DK63-887基因缺失株的构建及鉴定

为了构建羊布鲁菌16M(简称16M)的DK63-887基因缺失株(16MΔDK63-887),探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那基因替换DK63-887基因,获得突变株16MΔDK63-887。将亲本株16M、疫苗株M5-90、突变株16MΔDK63-887在相同条件下振荡培养,观察其生长趋势变化;将各菌株置于不同外界环境中,观察其生存率;将各菌株侵染小鼠巨噬细胞,比较它们在宿主细胞内的生存能力及RT-qPCR检测自噬相关基因的表达。成功获得了布鲁菌DK63-887基因缺失株且在20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16MΔDK63-887在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株在外界应激条件下生存能力低于亲本株;侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降;RT-qPCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P0.01),结果表明,布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M介导的细胞自噬密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。     

双元调控系统LisRK对单增李斯特菌抗酸应激与侵袭力作用的研究

【目的】 试验旨在阐明双元调控系统LisRK在单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)抵抗不利环境应激以及感染过程中的作用。【方法】 以参考菌株10403S为亲本株，利用穿梭质粒pKSV7通过同源重组方法构建lisRK基因缺失株，并基于表达质粒pIMK2构建了lisRK回补株；比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK在酸(pH 4.5)、渗透压(5% NaCl)和氧化(10 mmol/L H₂O₂)应激条件下的生长与存活能力及其对胃腺癌细胞MGC803和肠上皮细胞Caco-2的侵袭率，进一步比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK经腹腔注射感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量。【结果】 应激试验结果显示，lisRK基因缺失显著降低单增李斯特菌在酸应激(pH 4.5)条件下的生长能力，但不影响该菌在5% NaCl和10 mmol/L H₂O₂中的生长能力；缺失株ΔlisRK在强酸应激条件下(pH 2.5)的存活率(0.57%)极显著低于亲本株(2.07%)与回补株(1.97%)(P < 0.01)。细胞侵袭试验显示，缺失株ΔlisRK对肠上皮细胞Caco-2和胃腺癌细胞MGC803的侵袭率分别为2.04%和0.13%，极显著或显著低于亲本株与回补株(P < 0.01；P < 0.05)。小鼠感染试验显示，在感染后48 h，缺失株ΔlisRK在小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为7.42×10⁷和1.87×10⁷ CFU，均低于亲本株和回补株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量，但并无显著性差异(P > 0.05)。【结论】 双元调控系统LisRK缺失减弱单增李斯特菌的抗酸应激能力和对宿主细胞的侵袭能力。     

单增李斯特菌耐药基因tetM、ermB接合转移

为探讨食品源单增李斯特菌四环素耐药基因tetM和红霉素耐药基因ermB是否能向粪肠球菌水平传播,选择2株耐受四环素(tetM)和1株耐受红霉素(ermB)的单增李斯特菌为供体,1株耐受卡那霉素的粪肠球菌为受体菌进行滤膜接合试验。对接合子tetM和ermB基因及相关的转座子Tn196、Tn197进行PCR检测。结果显示,分别获得17,23株耐四环素接合子,28株耐红霉素接合子,接合转移率分别为3.4×10~(-7),4.6×10~(-7),5.6×10~(-7)。接合子均产生了与供体菌一致的四环素和红霉素耐药表型,并且PCR扩增到相应的tetM和ermB基因,其序列与供体单增李斯特菌的耐药基因序列一致,但未扩增到相应的转座子基因;证实单增李斯特菌四环素耐药基因tetM及红霉素耐药基因ermB可以向粪肠球菌水平传播并发挥耐药作用。     

1株环境源单增李斯特菌的分离鉴定及生物特性分析

【目的】探究牦牛屠宰场中存在的单增李斯特菌对牦牛肉造成污染的风险。【方法】通过细菌分离培养、形态观察、生化试验及分子学方法对牦牛屠宰场50份污水样品中的单增李斯特菌进行分离鉴定;通过PCR方法对分离株血清型和毒力基因进行鉴定和检测,并测定分离株在不同生长条件下D_{600 nm}值;通过细胞的黏附和侵袭试验及小鼠半数致死量(LD₅₀)确定分离株的毒力。【结果】从50份污水样品中分离出1株革兰氏阳性短杆状细菌。分离株在李斯特菌显色培养基上为蓝绿色菌落,镜检为革兰氏阳性两端钝圆的短杆状菌,疑似为单增李斯特菌。生化试验结果显示,分离株可水解七叶苷,发酵葡萄糖、麦芽糖和鼠李糖,MR、VP、动力、过氧化氢酶试验为阳性,甘露醇和木糖发酵试验为阴性。系统进化树显示,分离株与单增李斯特菌EDG-e具有高度同源性,序列相似性为99%,血清型鉴定其血清型为1/2a。毒力基因检测结果显示,分离株携带inlB、inlC、inlJ、actA、plcA、prfA、mpl、hly、inlA、SigmaB毒力基因。抗应激能力试验显示,分离株在低温、强酸、强碱、高盐、乙醇胁迫和氧化...     

单增李斯特菌(LM90)inlA单基因及inlB/inlA双基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为探究内化素inlA、inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌(LM)生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建了inlA基因缺失株(LM90-inlA)和inlB、inlA双基因缺失株(LM90-ΔinlB/ΔinlA),并对其生物学特性进行了初步研究。结果显示:PCR和测序结果证实成功构建了目的基因(inlA、inlB)缺失株;菌落PCR和测序结果显示2种缺失株在体外连续培养20代过程中均能稳定遗传;生长特性实验表明2种缺失株与亲本株生长差异无统计学意义(t_(LM90/LM90-ΔinlA=0.34),p0.05;t_(LM90/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.324,p0.05;t_(LM90-ΔinlA/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.008,p0.05)且inlA缺失后2缺失株对小鼠的LD_(50)分别升高了0.64、1.26个对数数量级。研究结果表明inlA基因和inlB基因对LM90的部分生物学特性具有一定的调控作用,这对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了参考依据,也为研究内化素介导LM穿越血脑屏障(BBB)的作用机制奠定了科学基础。