大通犊牦牛组织中线粒体SDH活性与其亚基mRNA表达的测定

为探讨高原低氧环境下大通犊牦牛线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)在不同组织中的表达模式以及SDH活性与其亚基mRNA表达量之间的关系,采用酶联免疫分析法(ELISA)对犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织中线粒体SDH活性进行测定;实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测组织中Sdha、Sdhb、Sdhc和Sdhd亚基mRNA表达量。结果表明:大通犊牦牛大脑、心肌、骨骼肌组织中线粒体SDH活性显著高于乐都犊牦牛;大脑组织中线粒体Sdh4个亚基mRNA表达量极显著高于乐都犊牦牛。结论:含野血大通犊牦牛组织线粒体SDH有氧代谢功能强于乐都犊牦牛;大脑组织线粒体Sdh4个亚基转录水平较高;大通犊牦牛大脑组织线粒体SDH活性与Sdh4个亚基mRNA表达量呈正相关。     

大通犊牦牛组织线粒体COX酶活性与亚基COX-Ⅰ、Ⅱ mRNA表达的相关性研究

为探讨"大通犊牦牛"组织线粒体COX活性与亚基COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量之间的关系。采用酶联免疫分析法(ELISA)对犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性进行测定;绝对定量荧光PCR(Real-time PCR)检测组织中COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量。结果显示:大通犊牦牛心肌、骨骼肌、大脑、肝脏组织线粒体COX活性高于乐都犊牦牛;大通犊牦牛组织间COX-Ⅰ基因拷贝数明显高于乐都犊牦牛(P0.05);大通犊牦牛组织间COXⅡ拷贝数以及乐都犊牦牛COXⅡ拷贝数均差异显著(P0.05),大通犊牦牛不同组织中的COX-Ⅰ、Ⅱ的表达量与乐都犊牦牛相比差异显著(P0.05)。结果表明:含野血的大通犊牦牛组织线粒体COX的氧化磷酸化作用要强于家犊牦牛;线粒体COX两种亚基mRNA变化与组织和品种有关;COX活性变化可使COX-Ⅰ、ⅡmRNA发生失调。     

不同发育期大通牦牛组织线粒体COX、SDH活性的测定

为了探讨不同发育期牦牛组织线粒体标志酶氧化供能的作用,试验采用酶联免疫分析法(ELISA)对青海省大通种牛场1日龄、1月龄、3月龄、6月龄犊牦牛心肌、骨骼肌、肝脏、大脑组织线粒体细胞色素C氧化酶(COX)、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性进行测定。结果表明:大通牦牛心肌、骨骼肌、肝脏、大脑组织线粒体COX、SDH活性在4个年龄组间差异不显著(P0.05),肝脏组织线粒体COX、SDH活性均高于其他组织。在同一海拔梯度,大通牦牛在发育期心肌、骨骼肌、肝脏、大脑组织线粒体氧化磷酸化作用及有氧代谢能力保持在相对稳定的水平。     

“大通牦牛”胎盘-胎儿组织线粒体SDH、CCO和ATP酶活性的测定

为探究牦牛发育早期低氧适应的生物学机制,以"大通牦牛"(海拔3 200 m左右)为研究对象,采用酶联免疫分析法(ELISA)和比色法对妊娠期4月龄牦牛胎盘、胎儿及出生1日龄牦牛组织中琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素C氧化酶(CCO)及三磷酸腺苷(ATP)酶活性进行测定。结果:胎儿和犊牦牛骨骼肌、心肌、肝脏及大脑各组织线粒体SDH、CCO活性差异均不显著(P>0.05);妊娠4月龄胎盘组织和胎儿肝脏组织线粒体中Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP 4种ATP酶活性均高于心肌、骨骼肌、大脑组织,差异显著(P<0.05);出生1日龄牦牛骨骼肌、心肌、肝脏及大脑各组织间4种ATP酶差异不显著(P>0.05),各组织中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均高于其他ATP酶活性。研究表明牦牛在发育早期组织线粒体中SDH、CCO保持相对稳定的水平,而ATP酶在物质运送、能量转换以及信息传递方面发挥重要的作用。     

大通犊牦牛心肌组织超微结构与HIF-Iα表达量早期发育变化特点的研究

为研究低氧环境下大通牦牛这一杂交品种其心肌组织在早期发育过程中的代偿性改变,本实验选取出生1日龄、1月龄、3月龄、6月龄大通牦牛为研究对象.采用超微结构形态学方法,通过定性定量的方法对出生1日龄、1月龄、3月龄、6月龄大通牦牛心肌细胞线粒体的超微结构变化特点进行分析;采用实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)...     

不同生长期大通牦牛心肌和骨骼肌线粒体抗氧化作用的研究

对青海大通种牛场1、30、180日龄、成年含野血牦牛心肌和骨骼肌线粒体中LDH、SOD活性和LD、MDA含量进行测定。结果显示,牦牛心肌、骨骼肌线粒体LD、MDA含量在年龄组间差异不显著(P>0.05);心肌线粒体LDH活性随年龄的增长呈现递减趋势,骨骼肌线粒体LDH活性在年龄组间差异不显著(P>0.05);牦牛心肌线粒体SOD的活性在年龄组差异不显著(P>0.05),1日龄牦牛骨骼肌线粒体SOD活性最低,其他3个年龄组差异不显著(P>0.05)。表明牦牛在生长发育阶段骨骼肌、心肌线粒体无氧代谢和抗氧化功能保持相对稳定的适应性代谢水平。     

大通牦牛心肌线粒体超微结构增龄性变化特点及低氧适应

为了探讨大通牦牛心肌组织对低氧环境的适应机制。选取大通牦牛作为研究对象,以平原黄牛作对照,通过显微体视学技术比较骨骼肌线粒体的平均截面积(Ax)、平均体积(V)、面数密度(NA,单位面积中线粒体数目)、体积密度(VV,单位体积骨骼肌纤维中线粒体的体积密度)。结果显示,大通牦牛心肌线粒体的平均截面积、平均体积随着年龄的增长,表现为逐渐降低的特点;而面数密度表现为随着年龄增长呈现逐渐升高的变化特点;体密度表现为随着年龄的增长逐渐增加,各年龄段差异显著(P0.05);大通牦牛心肌线粒体与同日龄平原黄牛比,表现为线粒体大、数量少和体密度大的特点,差异极显著(P0.01)。结果表明,大通牦牛心肌线粒体在出生时已表现出对高原低氧环境的良好适应性,表现为骨骼肌线粒体平均体积大、面数密度低、体密度高的特点;而在个体生长发育过程中,大通牦牛心肌线粒体平均体积逐渐变小、面数密度逐渐增大,而体积密度逐渐增大的特点,这种变化特点可以满足机体生长发育的需要和对外界环境的适应。     

iNOS在大通牦牛和平原黄牛肺脏组织中增龄性表达变化研究

为了阐明大通牦牛肺脏组织中诱导型一氧化氮化酶(iNOS)随着年龄增长的变化趋势和特点,试验从青海省大通县(海拔3 200 m)选取健康的1日龄、30日龄、180日龄和成年的大通牦牛作为研究对象,同时选择湖北省襄阳市(海拔约100 m)相同发育阶段的平原黄牛作为对照,采用实时荧光定量PCR和Western-blot分析,从基因和蛋白质水平对大通牦牛iNOS在不同发育阶段中的表达情况进行研究。结果表明：随着年龄增长,大通牦牛肺脏组织iNOS基因表现为先降低再升高的趋势,与成年时比较,1日龄时相对表达量最高(P<0.05),30日龄时相对表达量最低(P<0.05);平原黄牛表现为随着年龄增长逐渐降低的趋势,与成年时比较各日龄时均差异显著(P<0.05)。相同发育阶段,1日龄时大通牦牛肺脏组织iNOS基因相对表达量显著高于平原黄牛(P<0.05),30日龄时显著低于平原黄牛(P<0.05),180日龄时差异不显著(P>0.05),成年时显著高于平原黄牛(P<0.05)。肺脏组织iNOS蛋白表达,无论是不同发育阶段的变化趋势,还是相同发育阶段的表达特点,...     

不同海拔地区牦牛心肌、骨骼肌线粒体标志酶的测定

采用酶联免疫分析法(ELISA)和比色法对青海省泽库、海晏县牦牛心肌和骨骼肌线粒体标志酶琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)和三磷酸腺苷(ATP)活性进行测定,并与甘肃黄牛进行对比。结果显示:泽库牦牛心肌、骨骼肌线粒体SDH、ATP活性显著高于海晏牦牛和甘肃黄牛(P<0.05),而海晏牦牛和甘肃黄牛差异不显著(P>0.05);泽库、海晏牦牛和甘肃黄牛心肌、骨骼肌线粒体CCO活性差异均不显著(P>0.05)。表明随着海拔的升高,牦牛心肌、骨骼肌线粒体标志酶SDH、ATP表达量增加,肌组织有氧代谢能力增强。     

一日龄大通牦牛和平原黄牛骨骼肌显微结构的比较

为了探讨1日龄大通牦牛骨骼肌组织学特点及对低氧的适应,以平原黄牛为对照,利用光镜和计算机图像分析系统测定骨骼肌肌纤维直径、表面积密度;通过透射电镜比较骨骼肌线粒体的面数密度、面积密度、体积密度、平均体积等结构参数。结果显示,1日龄大通牦牛骨骼肌肌纤维直径显著细于1日龄平原黄牛,表面积密度明显大于平原黄牛,差异极显著(P<0.01);1日龄大通牦牛骨骼肌细胞中线粒体平均体积小于1日龄平原黄牛,并具有极显著差异(P<0.01);而1日龄大通牦牛骨骼肌细胞中线粒体体积密度、面积密度、面数密度均大于1日龄平原黄牛,且差异极显著(P<0.01)。以上结果表明,大通牦牛通过增加骨骼肌线粒体面数密度、面积密度、体积密度,降低线粒体平均体积来提高其在低氧环境中对氧的利用,并且在长期进化中形成了肌纤维直径小,表面积密度大的组织学特点。     

高原牦牛肺脏组织iNOS基因表达的增龄性变化特点

为了阐明高原牦牛肺脏组织iNOS基因表达随年龄增长的变化趋势及特点,试验以1日龄、30日龄、180日龄和成年四个发育阶段的高原牦牛为研究对象,采用qRT-PCR及Western-blot方法对不同发育阶段牦牛肺脏组织iNOS mRNA及蛋白相对表达进行测定。结果表明:从出生至成年,高原牦牛肺脏组织iNOS mRNA及蛋白表达水平均表现为先增高后降低的趋势,这可能是高原牦牛肺脏组织在生长过程中为适应高原低氧环境而形成的适应策略。     

大通牦牛心肌低氧适应的组织学特点

选取两个海拔高度大通牦牛作为研究对象,以乐都地区牦牛为对照,利用光镜技术和计算机图像分析系统测定心肌肌纤维直径、表面积密度;利用透射电镜技术比较心肌线粒体的平均体积(V)、体积密度(VV)和面数密度(NA)等结构参数;利用免疫组织化学技术对心肌细胞血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)进行检测,并对以上数据进行相关性分析。结果显示:(1)大通牦牛心肌肌纤维直径均细于乐都地区牦牛心肌肌纤维直径,肌纤维表面积密度均高于乐都地区牦牛,且三者两两比较差异显著(P<0.05);(2)大通牦牛的VEGF和MVD均高于乐都地区牦牛,差异显著(P<0.05);(3)大通牦牛心肌线粒体的V和VV均大于乐都地区牦牛,差异显著(P<0.05);海拔3 700m的大通牦牛心肌线粒体面数密度大于海拔3 200m的乐都地区牦牛,差异显著(P<0.05)。结果表明,大通牦牛心肌组织主要表现为心肌纤维直径细、表面积密度大、心肌组织血管内皮生长因子和微血管密度大的遗传学特点。而心肌线粒体的低氧适应表现为,随着海拔高度的增加,心肌线粒体平均体积增大,面数密度和体密度增加的特点。     

不同发育期大通牦牛心肌、骨骼肌线粒体ATP酶活性的测定

对青海省大通牦牛1、30、180日龄及成年组心肌和骨骼肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性进行测定。结果显示,牦牛心肌、骨骼肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在年龄组间差异均不显著(P>0.05)。表明大通牦牛在生长发育阶段心肌、骨骼肌线粒体ATP酶在物质运输、能量转换及信息传递等方面发挥着稳定的作用,且与年龄之间无明显的线性关系。     

1日龄大通牦牛肺血管低氧适应的组织学特点

为了探讨大通牦牛肺血管对高原低氧环境适应的遗传学特点,试验选取不同海拔梯度1日龄大通牦牛为研究对象,并以平原黄牛为对照,采用光镜技术和透射电镜技术研究肺细小动脉中的平滑肌含量和肺气-血屏障结构。结果表明:1日龄大通牦牛肺细小动脉中平滑肌含量随着海拔的增加而增大,且差异极显著(P0.01);而1日龄大通牦牛的肺气-血屏障的算术平均厚度均厚于1日龄平原黄牛的肺气-血屏障,且差异极显著(P0.01)。大通牦牛出生时,肺组织表现为平滑肌含量较多,肺气-血屏障较厚,这种结构特点是大通牦牛对高原低氧环境的适应性特征。     

牦牛大脑皮质线粒体腺苷酸转运酶基因克隆及表达

为了研究腺苷酸转运体1和腺苷酸转运体2(ANT1和ANT2)基因在牦牛大脑不同区域中的表达,试验采用Real-time PCR的方法测定ANT1、ANT2在牦牛大脑不同区域中的表达量。结果表明:在牦牛大脑不同区域中ANT1、ANT2均有表达,且表达存在差异性(P0.05);另外,在大脑相同区域内ANT1的表达量均高于ANT2,亦存在差异性(P0.01)。说明ANT1和ANT2在牦牛大脑不同区域的特异性表达可能与牦牛大脑不同区域或不同区域内线粒体对低氧的敏感度不同有关;同时,ANT1基因高于ANT2基因的表达可能更利于牦牛脑线粒体在满足自身的能量代谢的同时适应低氧下对脑组织能量的供给。     

不同日龄牦牛大脑视皮质发育的组织形态学研究

为探明不同发育阶段牦牛大脑视皮质的组织形态结构,应用组织学技术及图像分析软件对不同发育期(1日龄、30日龄、180日龄和成年)对牦牛大脑视皮质厚度、神经元密度和神经元截面积进行分析测量。结果表明,随着年龄的增加,牦牛大脑视皮质的厚度增厚、神经元截面积增大和神经元密度在30日龄时最大,显著高于180日龄和成年组(P<0.05)。结果提示,牦牛大脑视皮质的厚度和神经元截面积从出生到成年逐渐增加,神经元密度从30日龄到成年则逐渐减少。     

牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的克隆及其在各组织和不同生长阶段肝中的差异表达分析

旨在克隆牦牛胰岛素样生长因子结合蛋白4和5（insulin-like growth factor binding protein 4 and 5,IGFBP4 and IGFBP5）基因,并检测其在牦牛不同组织及不同生长阶段肝中的表达水平。本研究选取1日龄、15月龄和5岁龄健康雌性麦洼牦牛共9头（每组各3头）,体重分别约为（12.35±1.85）、（98.88±2.50）和（268.55±27.82） kg,采集5岁龄牦牛心、肝、脾、肺、肾、小肠组织及3个不同生长阶段牦牛肝组织。本试验克隆IGFBP4和IGFBP5基因,并对其序列进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法、Western blot技术与免疫组化技术检测其在5岁龄牦牛6种组织及1日龄、15月龄和5岁龄3个不同生长阶段肝中的表达差异。结果表明,获得牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的CDS序列分别为777和816 bp,分别编码258和271个氨基酸,GenBank序列号分别为MT012934和MT003005。在同源性比较中,牦牛IGFBP4和IGFBP5序列均与黄牛的同源性最高,分别为99.6%、99.5%。组织表达谱分析显示,IGFBP4和IGFBP5基因均在5岁龄牦牛肝中表达量最高,与肾、心、小肠、脾、肺相比差异极显著（P<0.01）,且6种组织中IGFBP4基因的表达量均极显著高于IGFBP5基因（P<0.01）。不同生长阶段肝中差异表达结果显示,随着年龄的增长,IGFBP4和IGFBP5的mRNA与蛋白水平在牦牛肝脏组织中的表达量均呈现上升趋势,即5岁龄>15月龄>1日龄,在5岁龄时表达量最高,与1日龄和15月龄均存在极显著差异（P<0.01）,且IGFBP4的表达量极显著高于IGFBP5（P<0.01）。结果提示,IGFBP4和IGFBP5可能协同调控牦牛肝的生长发育,这为深入研究IGFBP4和IGFBP5在牦牛肝生长发育过程中的作用以及表达调控提供了一定的基础数据。     

高原牦牛肺脏组织诱导型一氧化氮合酶基因表达分析

为了阐明高原牦牛诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达对高原牦牛肺脏组织低氧适应作用的影响,试验采用实时荧光定量PCR方法,对不同品种、不同海拔高度的牦牛iNOS的mRNA相对表达量进行相关分析。结果表明:iNOS在转录水平上总体表现为随海拔的升高而升高的趋势,且父本来自海拔5 000 m以上的大通牦牛肺脏组织的iNOS mRNA相对表达量最高。说明牦牛iNOS mRNA相对表达量与海拔和品种均有一定的相关性。     

不同发育期牦牛血清和组织中一氧化氦含量的测定

为了探讨血清和组织中一氧化氮（NO）含量的变化与牦牛不同生长发育期的关系，采用硝酸还原法分别测定1日龄、1月龄、6月龄和成年牦牛4个年龄组血清和心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌组织中NO的含量。结果：1日龄犊牦牛血清中NO含量最高，随着年龄的增长呈现递减的趋势，差异显著（P〈0．05）。犊牦牛组织中NO含量显著低于血清中含量，差异显著（P〈0.05）；1月龄肝脏、肾脏和骨骼肌中NO含量明显增加，1日龄和1月龄组织NO的含量均高于6月龄，差异显著（P〈0．05），其余组织中NO含量的变化无统计学意义。结果表明：NO与牦牛不同生长发育阶段之间存在着一定的相关性。     

不同发育期牦牛血清和组织中一氧化氮含量的测定

为了探讨血清和组织中一氧化氮(NO)含量的变化与牦牛不同生长发育期的关系,采用硝酸还原法分别测定1日龄、1月龄、6月龄和成年牦牛4个年龄组血清和心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌组织中NO的含量。结果:1日龄犊牦牛血清中NO含量最高,随着年龄的增长呈现递减的趋势,差异显著(P<0.05)。犊牦牛组织中NO含量显著低于血清中含量,差异显著(P<0.05);1月龄肝脏、肾脏和骨骼肌中NO含量明显增加,1日龄和1月龄组织NO的含量均高于6月龄,差异显著(P<0.05),其余组织中NO含量的变化无统计学意义。结果表明:NO与牦牛不同生长发育阶段之间存在着一定的相关性。