β-葡聚糖酶产生菌的分离、筛选及鉴定

采用刚果红平板筛选法从动物粪便中分离和筛选高产β-葡聚糖酶的菌株,选取水解圈直径与菌落直径比值较大的菌株进行酶活力的测定,得到一株酶活力较高的菌株T-4-3,酶活力达到21.9 U/mL。对该菌株进行形态观察和生理生化特征分析,初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),将其16S rDNA序列与GeneBank中已知标准菌株的16S rDNA序列进行比对,并用Neighbor-joining方法构建菌株T-4-3进化树,结果表明,T-4-3与标准菌株CP000560 Bacillus amyloliquefaciens聚于同一分支,同源性高达100%。     

几丁质酶高产菌株HF-3的筛选及发酵条件研究

为了筛选一株高产几丁质酶菌株,试验采用透明圈法,从长江沿岸、森林土壤泥浆样品中分离几丁质酶生产菌株,得到一株几丁质酶高产菌株(HF-3),进行了生理生化特性、菌落形态及16S r DNA序列测定,并采用单因素优化方法筛选最佳产酶条件。结果表明:该菌为地衣芽孢杆菌;在培养温度为34℃、接种量为5%、胶体几丁质为碳源、表面活性剂为吐温-80时,酶活力达1.58 U/m L,此为最佳产酶条件。     

高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究

为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis) A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子P_eno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP) gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-P_eno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-P_eno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中P_eno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子P_eno、GFP及PBP1b (GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD_600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western bl...     

利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_tufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。     

淋巴细胞活化基因-3蛋白表达与生物信息学分析

为了研究淋巴细胞活化基因-3蛋白的生物学特性,试验采用PCR方法扩增淋巴细胞活化基因-3胞外区序列,构建重组质粒,将重组质粒转染至HEK293感受态细胞中表达目的蛋白,并对目的蛋白进行SDS-PAGE及Western-blot检测,通过ProtParam软件分析淋巴细胞活化基因-3蛋白性质,通过SWISS-MODEL软件预测蛋白质结构。结果表明:PCR法成功扩增出目的条带,大小约为1 430 bp,1. 0%琼脂糖凝胶电泳显示酶切成功;经10%SDS-PAGE凝胶电泳分析,在68 ku处出现目的条带,目的蛋白成功表达;纯化后的蛋白质经Western-blot检测证明具有特异性;目的蛋白具有22种可能的折叠形态,理论等电点pI值为9. 08,蛋白质结构不稳定,亲水性较差。说明试验成功表达了淋巴细胞活化基因-3蛋白。     

小鼠脑14-3-3ζ蛋白的基因克隆及鉴定

提取小鼠脑组织总RNA,采用RT-PCR法扩增14-3-3ζ蛋白的cDNA,将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体上,并用双酶切法和PCR法对结果进行鉴定。结果显示,RT-PCR扩增出1条大小约为738 bp的特异性条带,双酶切法和PCR法鉴定结果表明,PCR产物已被克隆到pGEM-T Easy载体中。DNA测序结果表明,所克隆的DNA片段与GenBank中已收录序列一致,表明小鼠脑14-3-3ζ蛋白重组pGEM-T克隆载体构建成功。     

猪链球菌2型安徽分离株毒力基因cps2J、mrp、epf、sly的检测及其序列分析

为了解19株猪链球菌2型(S.suis 2)安徽分离株的毒力基因型及毒力基因变异情况,通过PCR扩增S.suis 2毒力基因cps2J、mrp、epf和sly,对这4种毒力基因的扩增片段进行序列测定,并与国内外其他分离株的基因序列进行比较.结果显示,cps2J、mrp、epf和sly基因在19株S.suis 2中的检出率分别为100％、68.4％、68.4％、78.9％;19个受试菌株共分为7个毒力基因型,其中cps2J+/mrp+/epf+/sly+占57.9％,为优势基因型;S.suis 2安徽分离株4种毒力基因的检测序列之间及其与国内其他地区S.suis 2分离株的相应序列同源性均在99.1％以上,与国外S.suis 2分离株的相应序列同源性在87.8％～100％之间;19株cps2J+菌株中有1株菌cps2J基因序列有变异,13株mrp十菌株中有6株菌mrp基因序列发生变异,检测的epf和sly基因序列没有变异.表明cps2J +/mrp+ /epf+/sly+是S.suis 2安徽分离株优势毒力基因型,检测的S.suis 2安徽分离株cps2J、epf和sly基因部分序列较保守,mrp基因部分序列存在较大的变异.     

芽孢杆菌CY1—3株碱性纤维素酶基因celC的克隆及其在大肠杆菌中的表达

芽孢杆菌CY1-3株基因组DNA经Sau3A Ⅰ部分消化后回收2～7 kb片段,构建了部分文库.通过刚果红染色鉴定,筛选出6个纤维素酶基因的阳性克隆子,经酶切鉴定为同一克隆子,命名为pGJc-1.经测序分析,该片段包含一个由1 593个核苷酸组成的开放阅读框（ORF）,命名为celC.经推导,celC基因编码由一531个氨基酸残基组成的CelC蛋白.氨基酸序列分析表明,CelC蛋白的氨基酸序列与多种细菌的β-1,4-内切葡聚糖酶具有很高的同源性.粗酶液的SDSPAGE分析表明,celC基因在大肠杆菌中所表达的CelC蛋白具有纤维素酶活力,其分子质量约为58 ku.     

山西猪链球菌2型主要毒力相关基因的克隆及分析

为了解37株猪链球菌2型(S.suis 2)山西分离株的毒力基因型及毒力基因变异情况,通过PCR扩增S.suis 2毒力基因GDH、SLY、EPF、MRP,对这4种毒力基因的扩增片段进行测定,并与国内外其他分离株的基因进行比较。结果显示,GDH、SLY、EPF、MRP基因在37株S.suis 2中的检出率分别为86.5%、70.3%、56.8%、62.2%;37个受试菌株毒力基因型主要为GDH+/SLY+/EPF+/MRP+占51.35%,为优势基因型;S.suis 2山西分离株4种毒力基因与国内其他地区S.suis 2分离株的相应基因之间同源性均在99.1%以上,与国外S.suis 2分离株的相应序列同源性在89.9%~100%之间。     

猪链球菌耐药现状分析及感染防控措施

猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)感染长期困扰我国养猪业的健康和可持续性发展，尤其耐药性菌株的出现阻断原本的链球菌病防治策略。针对近年来国内外S.suis的耐药性流行情况的总结，可以为防治S.suis感染提供有效措施。因此，作者首先总结近五年来在国内外多个地区规模化猪场S.suis感染情况(阳性率普遍>40%),其中我国各省市中流行范围最广的是血清2型菌株。随后，作者归纳了猪场中耐药性S.suis流行现状及其感染特点，发现规模化猪场中的耐药性S.suis集中出现在亚洲大陆以及欧洲且多数地区耐药性高达80%以上，以四环素类耐药菌株为主。而我国规模化猪场中耐药性S.suis主要以四环素类和大环内酯类耐药为主。此外，S.suis是人畜共患的病原，可以经呼吸道和血液造成全身感染。最后，针对S.suis菌株变异多的特点，作者提出了精准检测对于防控S.suis感染的重要性并总结了目前常用的快速检测手段。强调以疫苗接种为主的防控手段和联合用药及宿主导向的新型抗菌药物研发的防治措施，为后续S.suis的耐药性菌株感染的防治提供数据支撑。     

瘤胃4株纤维降解细菌的分离鉴定及其纤维降解特性

作者从蒙古绵羊瘤胃内容物中筛选出四株纤维素降解细菌并进行鉴定,将其编号为H1、H2、N1、N2,对菌株生长特性和纤维素酶活力进行测定,以期为后续试验提供试验材料。通过生理生化特征、DNA序列分析对分离菌株进行鉴定,比浊法测定细菌生长曲线,用还原糖法测定四株细菌的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、水杨苷酶活和微晶纤维素酶活力。结果表明:经鉴定,四株菌中H1、H2为黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens),N1、N2为链球菌(Streptococcus);生长曲线测定表明菌株H1生长延迟期为4h,H2、N1、N2均为3h,黄色瘤胃球菌最大菌体浓度出现在28h,链球菌为14h;四株细菌均具有良好的纤维降解特性,其中H2滤纸酶活力、羧甲基纤维素酶活力、微晶纤维素酶活力显著高于菌株H1、N1、N2(P0.05),H1滤纸酶活力最低,为0.08μmol·(mL·min)-1。本试验利用hungate滚管法分离出4株具有纤维素酶活力的细菌,可以满足后续试验需要。     

血清2型猪链球菌河南分离株毒力基因的鉴定及其cps2j全基因序列分析

为了解血清2型猪链球菌(S.suis2)河南分离株的毒力基因型及cps2j全基因突变情况,本研究扩增S.suis2毒力基因gdh、cps2j、mrp、ef 、sly、orf2和fbps,并对s.suis2的cps2j进行全基因序列测定和同源性分析.结果表明,gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8个S.suis2分离株中的检出率分别为100％(8/8)、100％(8/8)、62.5％(5/8)、75％(6/8)、87.5％(7/8)、100％(8/8)和100％(8/8);其中cps2j全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的S.suis2分离株同源性分别达98％和97％以上,以该基因构建的系统发育树表明8株S.suis2河南分离株与国内外不同参考株同源性高,亲缘关系密切.     

畜禽胆固醇合成关键酶HMGR的生物信息学分析

本研究利用ClustalX、Swiss-pdbviewer4.0.1等分析工具,对GenBank中猪、牛和鸡β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,为畜禽胆固醇生物合成及调控的分子机制研究提供理论基础。结果表明:猪、牛和鸡HMGR基因序列特点及编码蛋白质理化性质基本相同,均属不稳定类酶蛋白;保守结构域氨基酸序列具有高度的同源性,均含有保守的2个β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)结合基序和2个还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)结合基序;均有信号肽,属分泌型蛋白质;属于跨膜的疏水性蛋白,均有5个跨膜结构域;无规则卷曲和α-螺旋是HMGR多肽链中的主要结构元件;三维结构预测都呈"V"形;猪和牛HMGR基因的进化关系最近。由此可见,猪、牛和鸡HMGR组成、结构及生物化学性质相似、进化关系相近,不同动物HMGR的分离纯化方法及调控手段可以相互借鉴。     

自噬对布鲁氏菌在巨噬细胞内增殖情况的影响

为探究自噬作用对布鲁氏菌(Brucella)在巨噬细胞(Mφ)内增殖活力的影响,本研究将体外培养的Mφ细胞分组,分别采用自噬激活剂雷帕霉素(Ra)或抑制剂3-MA处理细胞,并在不同处理的细胞组中接种表达绿色荧光的重组猪种布鲁氏菌(rB.suis-GFP),在接种后0.5 h~24 h,一方面通过细胞中LC3-Ⅱ含量及Mφ内B.suis数量的测定,另一方面通过激光共聚焦显微镜观察LC3-Ⅱ与B.suis共定位情况。结果显示,感染B.suis后0.5 h,Mφ即可发生自噬作用,并且Ra+Mφ+B.suis组LC3-Ⅱ含量显著高于其它组,表明B.suis的感染能够促进Mφ内LC3-Ⅱ的形成,增强Mφ的自噬作用;另一方面,Ra+Mφ+B.suis组胞内B.suis数量显著高于3-MA+Mφ+B.suis组与Mφ+B.suis组,表明自噬作用能够促进B.suis在Mφ内的增殖;但随着胞内B.suis数量的增加,各组LC3-Ⅱ的水平却逐渐下降,表明B.suis感染Mφ数量达饱和后,Mφ虽然启动自噬作用杀灭了部分B.suis,但却不能完全抑制B.suis在Mφ内大量增殖。本研究为初步确定自噬在B.suis增殖过程中的作用提供了依据。     

黑曲霉和芽孢杆菌混合纤维素酶液的活性研究

对黑曲霉(Aspergillus niger)和芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)混合纤维素酶液的活性进行了研究.结果表明,当黑曲霉和芽孢杆菌粗酶液的体积比为41时,酶活力最高,达273.4 μg/(mL·min);混合酶液最佳反应pH为7～8;最佳反应温度为60℃.Mn2 和Fe2 对混合酶液的活力有显著的激活作用,而Mg2 存在一定的抑制作用.     

携带猪呼吸道冠状病毒S基因片段的重组腺病毒的构建及鉴定

利用RT-PCR技术扩增猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus,PRCV)AR310毒株的S基因主要抗原位点片段,构建了重组腺病毒中间载体pDNR-1r-S1和表达质粒pInt.AV1.SpaT-S1。采用Cre-LoxP同源重组腺病毒系统和共转染技术构建了携带PRCV S基因片段的复制缺陷型重组腺病毒,经目的基因PCR检测和序列测定,结果表明:PRCV S基因片段已正确地插入到腺病毒基因组中;Western blot和间接免疫荧光实验证明目的片段在HEK293细胞中成功地获得了表达;子代重组腺病毒Ad5-PRCVS1的滴度为7×107 TCID50/mL。携带PRCV S基因片段重组腺病毒的构建为PRCV和TGEV重组腺病毒新型疫苗的研究奠定了基础。     

桑萜类生物合成酶HMGR的生物信息学分析

萜类化合物是桑叶具有药用功效的主要化学成分之一。利用Vector NTI Suit 8等工具,对GenBank中的桑萜类生物合成关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的核苷酸和氨基酸序列进行了生物信息学分析。桑hmgr基因序列以基因组DNA形式登录,其中1-5 905 bp区间为该基因序列,包括启动子、CDS和内含子序列,推测其编码蛋白的分子式为C2602H4181N715O786S29,亚细胞定位于线粒体,存在跨膜结构域,且含有22个氨基酸的质体转运肽,是含有HMG-CoA-reductase-classⅠ重要功能域的疏水性蛋白,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构中含有2个HMG-CoA和2个NADP(H)结合位点。     

一株纤维降解菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达及酶学性质分析

试验对1株娄彻氏链霉菌(B5)的β-葡萄糖苷酶(高活性纤维降解酶)基因进行克隆,通过构建高效表达的载体实现基因表达,对所得表达产物的酶学性质进行测定分析,为饲用纤维素酶的开发利用提供参考。通过PCR扩增B5的Egl基因的完整CDS序列,构建pET-32a-egl表达载体,转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。试验成功构建了高产β-葡萄糖苷酶的基因工程大肠杆菌,实现了β-葡萄糖苷酶的分泌表达,其分子量约4.1×10-4 U,酶学特性分析表明,在40℃、pH值8、底物浓度为3.0×10~(-2) mol/L时,酶活力最高,为1 085 U/mL。     

猪嗜血支原体酶标单抗阻断ELISA检测方法的建立

为确定猪嗜血支原体(M.suis)在临床的感染情况和进行流行病学调查提供检测方法,本研究以纯化的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白和辣根过氧化酶标记的MSG1蛋白单抗建立了检测猪嗜血支原体的阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.5μg·mL-1,待检血清最佳稀释度为1∶1,作用时间为37℃1.5h,酶标单抗最佳稀释度为1∶10 000,作用时间为37℃1h.通过对100份M.suis阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥23.71％时判为阳性,PI≤36.35％时判为阴性,23.71％＜PI＜ 36.36％时判为可疑.敏感性、特异性和重复性试验证明该检测方法敏感性高、特异性强、可重复性好,可用于M.suis流行病学调查和疾病诊断.