奶牛精子变形期间Pld6基因表达及蛋白序列分析

本研究旨在揭示精子线粒体鞘形成机制,提高种公牛繁殖潜力。采集3头健康状况良好、15～17月龄荷斯坦公牛睾丸和附睾组织,通过冷冻切片和激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术获取圆形和长形精子细胞,浮游法获取附睾尾精子,并采用TRizol法提取各样本RNA,对奶牛精子形成过程中的转录组进行差异分析和q PCR检测,利用生物信息学技术对其中Pld6蛋白结构和功能进行预测分析。结果表明,在精子形成过程中,Pld6基因在圆形～长形精子细胞发育过程中表达升高,而在成熟过程中转录降低甚至关闭。Pld6基因富集在线粒体融合(mitochondrial fusion)条目上,与精子尾部中段线粒体分布和形态结构相关,其蛋白为跨膜蛋白,第10～32位氨基酸是跨膜区域,三级结构呈喇叭状,在喇叭内部具有保守且呈β折叠的H(X) K(X4) D (HKD)酶活性结构域,与小鼠Pld6结构相似,且两者具有最接近的进化趋势。综上表明,根据小鼠研究推断牛精子变形过程中,Pld6基因表达增多可诱导线粒体向精子细胞尾部中段聚集,促进了线粒体鞘的正常形成,对确保牛精子活力及受精能力具有重要作用。     

牦牛精子总RNA提取方法的研究

实验旨在制备并获得足够数量和高质量的牦牛精子总RNA,经3倍体积45%Percoll单层梯度液纯化牦牛精子后,采用试剂盒(RNeasy Kit)、热TRIzol和TRIzol一步法分别提取精子总RNA,使用超微量紫外分光光度计分析,并进行RT-PCR和凝胶电泳。结果表明:纯化的牦牛精子中体细胞基本去除;3种方法提取精子总RNA均无基因组DNA污染,可获得GAPDH基因条带(126 bp);与热TRIzol和TRIzol一步法相比,试剂盒提取的总RNA(OD260/280=1.89,浓度为0.33μg/107精子)质量更高(P0.05),且能扩增出完整的β-actin、SRY、RPS23基因3条带。结果显示,试剂盒能获得高质量的牦牛精子总RNA,其纯度和完整性高,为后续分子生物学研究奠定基础。     

山羊睾丸生精细胞体外培养和鉴定

试验采用两步酶消化法对2月龄公羔睾丸进行处理,得到了总数为7.44×109的生精细胞悬液,经台盼蓝染色,细胞活率在90％以上;支持细胞的贴壁性极好,生精细胞附着在支持细胞上,随着培养时间延长,生精细胞、支持细胞逐渐退化,呈现“集合”的趋势,细胞数量逐渐减少;经BrdU标记、H.E.染色,检测培养的生精细胞到分化到圆形精子细胞阶段,表明成功构建了山羊睾丸生精细胞共培养体系,可为后续深入研究山羊精子体外成熟培养提供一定的实验依据.     

奶牛精子RNA提取

优选3头公牛细管冻精,采用上游法获得纯化精子,以含体细胞污染的精子作对照,应用离心层析柱方法和Trizol一步法相结合提取总RNA,紫外分光光度计检测总RNA的D260/280值和产量,并对总RNA进行RT-PCR和凝胶电泳。结果显示,纯化的牛精子中不含体细胞,奶牛细管精液总RNA在2 h内完成提取,D260/280值为1.80,大于200 bp的总RNA产量为0.92 μg/107个精子,精子总RNA进行RT-PCR,电泳后可得到清晰的SRY、LEP和RPS23基因3条带,不含18S rRNA基因条带。结果表明,离心层析柱法和Trizol一步法相结合可获得高质量的奶牛精子总RNA,且纯度和完整度高,可满足分子生物学研究的要求。     

PHGPx在体外共培养山羊睾丸生精细胞中的定位研究

为探讨磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在雄性动物生殖机能中的作用及其在体外培养山羊睾丸生精细胞的定位,在已成功构建的山羊睾丸支持细胞-生精细胞共培养的基础上,制作细胞爬片,采用免疫细胞化学技术定位PHGPx的表达。结果显示,PHGPx在支持细胞、精原细胞中不表达,在圆形精子细胞细胞质检测到阳性表达产物。表明PHGPx在精子发生后期圆形精子的变态发育中起特定的调节作用,但作用机制有待深入研究。     

利用流式细胞仪建立牦牛X、Y精子分选体系的研究

旨在探索与优化牦牛精子分选条件,建立高效的牦牛X、Y精子分选技术体系.本研究制备了牦牛精液细胞悬液,采用不同量的DNA染料Hoechst33342和诱惑红共孵育精子细胞.利用流式细胞仪分选牦牛X、Y精子,通过比较分选效率、分选后精子活力及发育潜能,优化分选条件.运用RT-PCR检测分选精子的纯度,利用精子分析系统检测分...     

BMP15在不同月龄水牛睾丸中差异表达研究

为了提高水牛的繁殖效率,探明骨形态发生蛋白15(BMP15)在水牛生殖中的调控机制,试验以3,4,5,6月龄水牛睾丸组织为研究对象,采用免疫组化染色法分析BMP15及其受体激活素受体样激酶5(ALK5)的表达定位。结果表明:在3月龄组中BMP15免疫阳性产物主要定位于精细管上皮的精原细胞中;而4月龄组在精原细胞和间质细胞中均有表达定位;5月龄组主要定位于圆形精子细胞和变形精子中,睾丸间质细胞和精原细胞中均未检测到免疫阳性产物的存在;6月龄组又重新在精细管上皮的精原细胞和圆形精子细胞中检测到了BMP15免疫阳性产物。ALK5免疫阳性产物也定位于精原细胞、精子细胞和间质细胞中。说明BMP15可能参与精子的发生周期,在精子发生和成熟过程中起到一定作用。     

云南半细毛羊精子冷冻前后转录组表达差异分析

【目的】 本研究旨在对云南半细毛羊精子冷冻前后差异表达的基因与精子冷冻损伤的关系进行研究。【方法】 采用电刺激法采集3只云南半细毛羊精液,各分成2份,一份直接用于提取精子RNA,另一份经过冷冻保存7 d后再进行精子RNA提取。利用获得的精子RNA,采用单细胞转录组测序技术分别检测新鲜精子和冻融精子的mRNA转录组,构建mRNA转录组文库,用Hiseq2500测序仪进行测序,对测序结果做进一步过滤处理,然后对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路分析。【结果】 6份精液样本共产生623 399 754条原始测序序列,过滤处理后得到514 313 802条（82.50%）高质量的Clean reads。生物信息学分析结果表明,冷冻前后差异表达显著的基因共1 213个。其中,解冻后表达量下调的有1 208个,上调的有5个。通过GO功能注释和KEGG通路富集分析,差异表达基因分别归类于56个GO分类,参与40个信号通路。其中与精子功能密切相关的主要包括精子细胞过程、代谢过程、应激反应、生殖、质膜和氧化还原反应;精子冷冻前后差异表达基因参与的信号通路主要有炎症、细胞因子-细胞因子受体相互作用和细胞凋亡等通路。【结论】 云南半细毛羊精子的冷冻损伤可能与获得的差异表达基因参与的生物过程有关。此外,获得的差异表达基因也可作为分子标记物应用于绵羊冻精品质的评价。     

哺乳动物成熟精子的转录及翻译活性研究进展

精子形成过程中存在经典的"转录-翻译解偶联"现象.精子变形过程中将大量RNA贮存在核糖体颗粒蛋白RNPs和多聚核糖体中,以便在特定发育阶段被激活翻译.近年来的研究表明,获能反应以及冷冻、性别筛选、外源添加剂孵育等体外操作均会改变成熟精子的蛋白质组,线粒体作为精子获能过程中部分蛋白翻译的场所,具有重要作用.本文围绕成熟精...     

脱氢表雄酮对雄性小鼠睾丸组织发育的毒性作用

昆明种雄性小鼠32只,随机分为4组。脱氢表雄酮（DHEA）日摄取量分别为0（对照组）、20、40和60mg／kg,试验期52d。各组分别在42日龄、72日龄处死小鼠,分离睾丸,制作石蜡切片,HE染色,显微观察、摄影。结果显示,与对照组比较,42日龄时中、高剂量组的曲精小管断面变形,各时期的生精细胞和成熟精子数量均减少;高剂量组曲精小管内生精细胞层次基本消失,出现较大腔隙,间质发生不同程度的变化。72日龄时中、高剂量组的曲精小管断面变形。基膜变薄伴有断裂和间质受损增加。中剂量组出现畸形精子,高剂量组曲精小管中央空白区域增大,缺乏成熟精子。以上结果表明,中、高剂量的DHEA对生长期小鼠的睾丸组织结构发育有明显的毒性作用。     

牛精子头部显微注射受精试验

牛体外受精研究发展迅速。利用体外受精技术,可使体外培养成熟的牛卵泡卵子受精,并培养发育成囊胚,将新鲜的或经过冷冻、解冻后移植给受体牛,最终获得犊牛。利用附睾尾部精子进行体外受精时,受精率在种公牛之间没有差异,而利用射出精子时个体间则差异很大。显微受精可以得到稳定而高的受精率,并缩小精子方面所引起的受精率差异。目前,显微受精有以下三种方法:透明带开孔法、卵黄周隙精子注入法、卵细胞质精子注入法。本文所报道的显微受精试验是用卵细胞质精子注入法。卵细胞质精子注入法是利用显微操作仪在显微镜下将一个精子或精     

公山羊Protamine 1 mRNA表达特性及与精液品质相关性的研究

旨在研究雄性山羊主要繁殖器官中PRM1mRNA表达特性,分析精子PRM1mRNA表达与精液品质参数的相关性。本研究通过荧光定量PCR技术分析PRM1mRNA表达规律,利用免疫组化技术对睾丸中PRM1蛋白进行定位,并应用GraphPad Prism 5软件分析精子PRM1mRNA表达量与精液品质指标的相关性。结果显示,PRM1mRNA在睾丸中高度表达,其次是附睾,睾丸中PRM1mRNA表达量是附睾头的247倍,附睾头显著高于附睾体和尾(P0.05),在剩余其他组织中微量表达。在周岁之前,睾丸中PRM1mRNA表达量随着月龄增加而增加,12月龄的表达量显著高于9月龄的表达量(P0.05),9月龄表达量显著高于其他低月龄的表达量(P0.05)。精子PRM1mRNA的表达量与精子活力(R2=0.586 0,P=0.000 5)、精子密度(R2=0.442 2,P=0.004 9)呈显著正相关。山羊PRM1在长形精子细胞和精子细胞中表达,睾丸其他生精细胞及间质细胞中无表达。山羊PRM1mRNA表达具有时空表达特性,PRM1mRNA表达量可以作为评价公羊繁殖力的指标。     

白藜芦醇对奶牛性控冻精品质和体外受精能力的影响

本研究旨在探究不同浓度白藜芦醇处理对奶牛性控冻精品质和体外受精能力的影响。在解冻后的奶牛性控冻精中分别添加0、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5) mol/L的白藜芦醇,各组精子在受精液中获能孵育1.5 h后,测定精子质量和体外受精能力。结果表明:添加白藜芦醇均可有效降低性控冻精中活性氧(ROS)含量、提高顶体完整活精子比例(P0.05),其中10~(-3)、10~(-4) mol/L的白藜芦醇处理对降低ROS含量最为显著;10-4 mol/L的白藜芦醇处理可显著降低丙二醛(MDA)含量并提高性控冻精的卵裂率和囊胚率(P0.05)。综上所述,白藜芦醇作为一种外源性天然抗氧化剂,通过降低性控精液中过量的ROS水平、抑制精子脂质过氧化反应、保护顶体完整性,从而提高性控精子质量和体外受精能力。     

靓精对猪精子、卵母细胞和胚胎的影响

靓精是一个消毒剂的新产品,可用于精液常温保存过程的微生物污染的预防。为了确认靓精对精子、卵子以及早期胚胎的影响,本实验利用病原抑制实验筛选出的三个靓精浓度,0.5%(v/v)、0.75%和1%,并分别添加至精液稀释液、卵母细胞成熟培养液、胚胎的培养液中,观察靓精对猪卵母细胞的成熟、胚胎发育、精子活力以及受精能力等的影响。结果表明,三个处理浓度的靓精对卵母细胞的成熟质量、体外发育能力,精子的运动和受精能力均无显著影响。因此,靓精作为广谱消毒剂,可以在猪精液常温保存过程中添加,以改善精液保存品质。     

牛冻、鲜精子差异蛋白的双向电泳和质谱鉴定的初步研究

采用适合于精子裂解的热Trizol法制备牛精子全蛋白质,应用线性固相IPG胶条（pH 3～7、24 cm）进行精子全蛋白2-DE电泳,在冻精和鲜精蛋白图谱中分别检测到839±34个蛋白点和564±16个蛋白点,经差异比较和显著性检验,在冻、鲜精子中共得到19个具有显著差异的蛋白点,在冻精中表达上调的蛋白点有9个,表达下调的蛋白点有1个,只在冻精中表达的蛋白点有9个。经过酶解和质谱鉴定,获得了3个差异蛋白点的质谱信息,生物信息学分析结果发现,这3个差异点分别为中性鞘磷脂酶激活结合因子（FAN）、谷胱甘肽S转移酶（GST-Mu5）及锌离子结合细胞色素氧化酶,分别与细胞应激和凋亡有关。推测认为,这3种与细胞应激反应及凋亡相关的蛋白在冻精中显著增高可能与精子冷冻损伤有关。     

羔羊睾丸支持细胞发育的组织学观察

为研究羔羊睾丸支持细胞发育过程中的形态学变化,本实验以湖羊1-5月龄的羔羊睾丸为材料,采用常规石蜡包埋、组织切片技术,应用Olympus DP71显微镜照相系统和DP Control软件拍照获取图像,观察了睾丸支持细胞、生精细胞的的形态学变化,利用显微测微系统测量了支持细胞大小、数量、生精小管管径以及面积变化。结果表明:性成熟前羔羊睾丸的解剖特征参数总体表现出左侧大于右侧;随着羔羊睾丸的发育,支持细胞的结构更加清晰完整,细胞体积逐渐增大,生精小管管径、睾丸支持细胞和生精细胞的数目都有增加,并没有在生精小管中发现圆形精子。性成熟之前,羔羊睾丸支持细胞的快速增长主要表现在生精小管直径显著性增大,随着羔羊睾丸生长发育,支持细胞的增殖能力增强,并对生精细胞的发育有一定的影响,本研究可为进一步研究不同季节及不同发情时期滩羊睾丸发育特征提供参考。     

铜、锌、硒、钙与公牛繁殖性能关系初探

本研究测定了公牛外周血(清)和精清中铜、锌、硒、钙元素的含量,并对照精液主要性能指标,探求其相互关系。结果表明,血清中铜锌、锌钙呈显著正相关,硒钙为负相关;血钙与精子冻后活力呈显著负相关,其他均不明显。精清中铜锌、锌硒、硒钙呈显著正相关,精硒的含量与精子冻后活力、顶体完整率也呈显著正相关。同步测定血清、精清,其锌、硒、钙在精清中含量明显高于血清中的含量,其中锌、硒相关显著;铜呈负相关,而且精清中的含量低于血清中的含量。     

精原干细胞的分离纯化方法

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是永久分化成精子细胞的克隆源, 既可以自我更新生成新的干细胞,又可以增殖分化形成各阶段的生精细胞直至成熟的精子. 由于精原干细胞可以进行体外培养、转基因操作、异体或异种移植重塑精子发生,以及可以 冷冻保存,所以在雄性不育治疗、转基因动物生产、遗传资源保护等方面有着广阔的应用前 景,成为新的研究热点.SSCs的分离富积是对其研究与应用的必要前提条件.然而,SSCs在 睾丸中所占比例极低,选择有效的分离纯化方法,获得富积的SSCs就成为推动其研究的关键 步骤.近年来,随着SSCs移植功能试验的建立,有关SSCs的分离纯化研究取得了长足进步,本文就此作一综述.     

小鼠Wip1基因的表达及其对受精能力的影响

本研究旨在探讨Wip1基因的表达及其对精子受精能力的影响,为阐明Wip1基因对雄性繁殖的影响提供新的着眼点。选取相同饲养环境、同一遗传背景的8周龄左右的野生型雄鼠,利用实时荧光定量PCR技术检测Wip1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织及雄性生殖器官中的表达情况,利用免疫荧光技术检测Wip1蛋白在睾丸组织及精子细胞中的分布情况。以Wip1敲除型雄鼠为试验组,野生型雄鼠为对照组,利用ELISA试剂盒检测两组小鼠血清中睾酮水平;通过体外受精试验比较两组的2-细胞率及囊胚率。结果显示,Wip1基因mRNA在野生型雄鼠各组织中广泛表达,且在雄性生殖器官中表达量较高,其中睾丸中表达量最高,附睾体、附睾头、附睾尾次之;Wip1蛋白主要定位于睾丸组织中的长形精子细胞及附睾成熟精子细胞的头部。ELISA检测结果发现,与野生型雄鼠相比,Wip1敲除型雄鼠血清内睾酮含量极显著下降(P0.01)。体外受精结果表明,Wip1敲除后2-细胞率及囊胚率均极显著下降(P0.01)。结果表明,Wip1基因敲除能够引起雄性小鼠受精能力降低,这可能与Wip1基因在精子发生过程中发挥作用相关。     

单侧睾丸动脉结扎／再通对小鼠生精上皮、血清抗精子抗体的影响

采用单侧睾丸动脉结扎／再通以研究其对小鼠睾丸生精功能以及血清中抗精子抗体IgG、IgM含量的影响。实验选择健康成年BALB／c雄性小鼠于显微镜下行单侧睾丸动脉结扎。再于2h、4h、6h后开通血管。ELISA法检测血清抗精子抗体IgG、IgM水平,光镜观察睾丸生精小管内变化。结果表明：与非术侧相比,术侧睾丸生精小管内生精细胞不同程度地凋亡坏死,生精上皮脱落。各手术组血清中抗精子抗体IgG、IgM含量均有明显增长（P〈0．05）。实验结论：单侧睾丸动脉结扎／再通可引起睾丸生精细胞的凋亡坏死,同时血清抗精子抗体IgG、IgM含量增加。