维生素C调控肉鸡缺氧肺动脉血管平滑肌细胞缺氧诱导因子-1α mRNA转录的分子机制

作者旨在通过脯氨酸羟化酶抑制剂(DMOG)和过氧化氢(H_2O_2)刺激肉鸡缺氧肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)探讨维生素C(VC)对其氧化还原状态与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体2(VEGFR2/Flk-1)mRNA转录调控的分子机制。在前期PASMCs培养和缺氧模型的基础上设计3个小试验,VC和H_2O_2、VC和DMOG、VC和H_2O_2+DMOG,每个试验5个处理,每个处理6个重复。结果表明:与常氧和缺氧空白组相比,试验1,VC显著增加SOD/MDA的比值(P0.05),显著下调HIF-1α/VEGF/VEGFR2mRNA的转录水平(P0.05),H_2O_2显著上调缺氧肉鸡PASMCs HIF-1αmRNA转录(P0.05);试验2,DMOG显著上调SOD/MDA的比值(P0.05),显著下调HIF-1α和VEGFR2mRNA转录(P0.05),但显著上调VEGF mRNA的转录(P0.05),VC+DMOG显著上调HIF-1α/VEGF/VEGFR2 mRNA转录(P0.05);试验3,VC+H_2O_2+DMOG三者同时添加极显著增加HIF-1α/VEGF/VEGFR2 mRNA转录(P0.01)。以上结果提示,VC能提升细胞外基质的抗氧化水平,其对缺氧基因表达的调控与细胞内脯氨酸羟化酶活性和氧化还原状态相关。     

缺氧诱导因子-1α与肉鸡腹水综合征

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是机体缺氧信号传导途径中一个关键的转录因子-缺氧诱导因子-1(HIF-1)的一个活性亚基,对人类和哺乳动物肺动脉高压的形成具有极其重要的病理生理作用。文章综述了HIF-1α与哺乳动物肺动脉高压发生发展的关系及其可能的作用机理与途径,对剖析HIF-1α在肉鸡腹水综合征发生发展中的作用机理具有一定的意义。     

缺氧条件下巨噬细胞移动抑制因子对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

本研究旨在探讨缺氧条件下巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响。取14~16日龄鸡胚,改良酶消化法分离培养肺动脉平滑肌细胞。采用氯化钴作为化学缺氧模拟剂处理肉鸡肺动脉平滑肌细胞,以低氧诱导因子1α(HIF-1α)为缺氧指标,摸索合适的氯化钴使用浓度,构建细胞缺氧模型;在此基础上使用阻断剂ISO-1阻断MIF,比较阻断前后细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达水平和细胞增殖水平的变化。利用Western boltting检测各蛋白表达水平,利用MTT法及细胞计数方法来检测细胞增殖水平。结果显示:经800μmol/L CoCl2处理24 h后肺动脉平滑肌细胞,HIF-1α表达较正常对照组极显著升高;与正常组相比,缺氧组肺动脉平滑肌细胞MIF及CyclinD1表达均显著升高;与缺氧组相比,阻断剂ISO-1处理后肺动脉平滑肌细胞MIF及CyclinD1表达均极显著升高。综上,缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞MIF表达量增加,通过上调CyclinD1的表达来促进平滑肌细胞的增殖。     

腹水综合征肉鸡肺脏缺氧诱导因子-1α基因克隆及表达研究

从21日龄患腹水综合征（AS）鸡肺脏中提取RNA,根据健康鸡胚心室肌细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因序列（登录号为NM204297）设计引物,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收后与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序.结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为1 576 bp.序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与鸡胚HIF-1α cDNA和氨基酸序列同源性分别为99%和98%.采用RT-PCR技术检测4只21日龄正常肉鸡和4只21日龄AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA,结果表明,AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡（P《0.01）.本试验证明,HIF-1α与肉鸡肺动脉高压导致的腹水综合征相关.     

缺氧与肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-fos和 c-myc基因表达的关系

利用细胞培养、原位杂交、免疫组化、图像分析等技术研究缺氧与肉鸡肺动脉平滑肌细胞癌基因c-fos和c-myc表达的关系,进一步阐明缺氧与以肺动脉增殖重塑为特征的肉鸡腹水综合征的关系。结果显示,缺氧显著引起肺动脉平滑肌细胞内癌基因c-fos和c-mycmRNA的表达(c-fosmRNA:常氧组为144.6±20.2,缺氧组为198.1±32.8,P<0.01;c-mycmRNA:常氧组为125.4±18.8,缺氧组为167.1±22.4,P<0.01)。缺氧显著引起肺动脉平滑肌细胞内癌基因c-fos和c-myc蛋白的表达(c-fos蛋白:常氧组为150.9±33.2,缺氧组为225.9±37.0,P<0.01;c-myc蛋白:常氧组为162.1±28.5,缺氧组为228.8±33.4,P<0.01)。结果表明缺氧能够明显诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞内癌基因c-fos、c-myc的转录和表达,是启动肺动脉平滑肌细胞增殖的重要原因。本研究阐明缺氧是以肺动脉重塑为特征的肉鸡腹水综合征的主要诱因。     

维生素C对大型黄羽肉鸡肺动脉高压综合征的影响

采取分组对比的方法（对照组，肺动脉高压综合征（PHS）发病组，维生素C治疗组）分别检测试验鸡只肝组织、肠黏膜、心肌线粒体中的NO含量和NOS的活性。结果显示，对于发生PHS的快大型黄羽肉鸡，其肝脏、心肌和肠黏膜线粒体NO含量呈现先显著上升后显著下降的变化趋势（P〈0．05）。线粒体NOS活力的变化趋势则与NO一致。与对照组相比，维生素C治疗组各指标则呈现相反的变化，说明其能有效地阻止快大型黄羽肉鸡发生PHS这一过程。     

饲粮添加Vc对腹水肉鸡缺氧诱导因子-1α基因表达及机体氧化与抗氧化能力的影响

通过饲粮添加1.5mg/kg三碘甲状原氨酸(3,3′,5-triiodothyronine,T3)诱导肉鸡产生腹水综合征(AS),研究了饲粮中添加不同剂量的VC对肉鸡机体氧化与抗氧化能力、肺脏缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因表达及AS发病率的影响。结果表明:饲粮中添加不同剂量的VC可不同程度降低肉鸡心脏指数和AS发病率,1000mg/kgVC可显著降低肉鸡心脏指数(P<0.05);饲粮VC可增加AS肉鸡肝脏和血液的总抗氧化能力,降低MDA的含量,饲粮添加100、1000和10000mg/kgVC可显著降低AS肉鸡肝脏和血液MDA的浓度(P<0.05),添加100、500和10000mg/kgVC可显著提高血液T-AOC活性(P<0.05);VC可以显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低AS肉鸡肺脏HIF-1αmRNA和蛋白质表达水平,在1000mg/kg时,HIF-1α蛋白的表达量达到极显著性差异(P<0.01);从血液生化指标来看,VC可降低AS肉鸡血液中乳酸的水平和乳酸脱氢酶(LDH)的活力,在500、1000mg/kg时达到显著性差异(P<0.05)。以上结果表明饲粮中添加1000mg/kgVC对肉鸡AS有较好的防治效果。     

维生素C对快大型黄羽肉鸡肺动脉高压综合征的影响

采取分组对比的方法(对照组,肺动脉高压综合征(PHS)发病组,维生素C治疗组)分别检测试验鸡只肝组织、肠黏膜、心肌线粒体中的NO含量和NOS的活性。结果显示,对于发生PHS的快大型黄羽肉鸡,其肝脏、心肌和肠黏膜线粒体NO含量呈现先显著上升后显著下降的变化趋势(P<0.05)。线粒体NOS活力的变化趋势则与NO一致。与对照组相比,维生素C治疗组各指标则呈现相反的变化,说明其能有效地阻止快大型黄羽肉鸡发生PHS这一过程。     

维拉帕米对肉鸡肺动脉高压发生过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos表达的影响

研究低温诱发肉鸡肺动脉高压过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达情况,及钙拮抗剂维拉帕米对c-Fos表达和肺动脉压的影响,从而探讨肉鸡肺动脉高压的发生机制。180只AA肉鸡14日龄随机分为对照组、低温处理组和维拉帕米组,14~49日龄,每组每周随机取6只测定肺动脉压,取肺组织固定做石蜡组织切片进行c-Fos免疫组织化学染色分析。结果显示,低温处理1周后肉鸡肺动脉压明显升高(P0.05),20~50μm肺动脉平滑肌细胞c-Fos表达在处理后1周开始明显升高,50~100μm肺动脉c-Fos表达在处理后2周开始明显升高(P0.05),而维拉帕米组肉鸡肺动脉压和c-Fos的表达在相应的时间内较低温组明显降低(P0.05)。结果表明肺动脉平滑肌细胞c-Fos在低温诱发的肉鸡肺动脉压升高的过程中表达增强,阻断钙通道可抑制肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的过高表达和肺动脉压升高。     

5-羟色胺对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

采用胶原酶消化法培养原代肉鸡肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,检测不同浓度的5-羟色胺（5-HT）对肉鸡PASMC增殖的影响,并用流式细胞仪检测PASMC周期和凋亡情况。结果发现,10-4～10-7 mol/L的5-HT能剂量依赖性地促进肉鸡PASMC的增殖,可能是5-HT加速细胞从G1期向S期过渡,同时5-HT也可促进PASMC凋亡,因此在总体上5-HT促进PASMC增殖的作用更明显。     

L-精氨酸对肺动脉高压肉鸡肺小动脉平滑肌细胞凋亡的影响

将240羽14日龄艾维茵-2000商品代肉鸡于14d时随机等分为常温对照组（NT组），低温组（LT组）和低温加L-精氨酸组（LA），白14d起，LT和LA组舍内温度从28℃以1～2℃／d的速度下降，至21d降至12～14℃，并维持到试验结束。此外，LA组自14d起在饲料中按100mg／kg剂量添加L—Arg，直至试验结束。记录肺动脉高压综合征（PHS）发病率，并分别于24、32、39和45d测定右心室／全心室质量比（RV／TV）、血浆NO、肺小动脉管壁面积／管总面积（WA／TA）和平均中膜厚度（mMTPA），并用原位缺口末端标记法（TUNEL法）对肺小动脉凋亡平滑肌细胞进行染色和计数。结果：LT组肉鸡PHS发病率、RV／TV、mMTPA和WA／TA值较NT组升高（P〈0．05）；LA组肉鸡PHS发病率较LT组降低（P〈0．05），mMTPA和WA／TA值与LT组相比呈下降趋势，在32d时显著降低（P〈0．05）；LT组血浆N0浓度总体上与NT组差异不显著（P〉0．05），仅在39d时降低（P〈0．05），而LA组血浆N0浓度自32d时起较NT和LT组显著升高（P〈0．05）；LA组肉鸡肺小动脉平滑肌凋亡细胞百分率较NT组和LT组均显著升高（P〈0.05），但LT组与NT组之间相比无显著差异（P〉0．05）。上述结果表明，L-Arg／NO通过促进肺小动脉平滑肌细胞凋亡，从而在一定程度上抑制了肺血管重构的形成。     

钙信号转导与缺氧诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞癌基因c-fos、c-myc表达的关系

利用细胞免疫组化、原位杂交技术研究钙信号与缺氧诱发肺动脉平滑肌细胞(PASMC)癌基因c-fos、c-myc表达的关系。结果显示,钙通道拮抗剂verapamil(V)、nifedipine(N)、Cyclosporin A(C)显著抑制缺氧引起的c-fos和c-mycmRNA的表达(其中c-fosmRNA:缺氧组198.1±32.8,缺氧 V组161.6±24.1,缺氧 N组173.7±35.8,缺氧 C组159.0±32.8,P<0.01;c-mycmRNA:缺氧组187.1±22.4,缺氧 V组150.5±22.6,缺氧 N组155.1±25.4,缺氧 C组148.9±29.7,P<0.01)。同时显著抑制缺氧引起的c-fos和c-myc蛋白的表达(其中c-fos蛋白:缺氧组225.9±37.0,缺氧 V组162.3±33.6,缺氧 N组157.4±28.9,缺氧 C组151.6±37.3,P<0.01;c-myc蛋白:缺氧组228.8±33.4,缺氧 V组170.2±26.7,缺氧 N组170.7±28.5,缺氧 C组179.1±29.2,P<0.01)。verapamil和nifedipine能够显著抑制缺氧引起的癌基因表达,表明钙信号转导参与了缺氧引起PASMC癌基因的表达过程。Cyclosporin A可显著抑制缺氧引起的癌基因的转录表达,表明钙信号转导系统中的Ca2 /CaM-CaN转导通路在PASMC增殖过程中具有重要作用。PASMC增殖是肉鸡腹水综合征的主要特征,钙信号转导激活引起PASMC增殖的c-fos和c-myc的转录表达,表明钙信号转导可能与肉鸡腹水综合征的发生发展密切相关。     

低氧诱导因子-1α对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响

本研究旨在探讨低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化（EMT）的影响。首先对牦牛肾小管上皮细胞进行培养鉴定,并选取第三代细胞对其分别进行药物处理（DMOG组）和不做药物处理（对照组）,检测EMT相关基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,并观察细胞形态变化。结果表明：使用Ⅰ+Ⅱ型胶原酶可以更好地获得肾小管上皮细胞;免疫荧光结果细胞CK18表达呈阳性,Vimentin和CD31呈阴性表达;qRT-PCR和Western blot结果表明,DMOG组中的HIF-1α,TGF-β1,α-SMA在mRNA和蛋白水平均较对照组有极显著增加（P<0.01）,而E-cadherin的表达显著降低（P<0.05）;经药物干预后,细胞形态由铺路石样转变为长梭形,经鉴定长梭形细胞为间质细胞。本研究成功建立了牦牛肾小管上皮细胞的分离培养体系,并发现HIF-1α表达上调可以促进牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化。     

低氧诱导因子-1α对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响

本研究旨在探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。首先对牦牛肾小管上皮细胞进行培养鉴定,并选取第三代细胞对其分别进行药物处理(DMOG组)和不做药物处理(对照组),检测EMT相关基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,并观察细胞形态变化。结果表明:使用Ⅰ+Ⅱ型胶原酶可以更好地获得肾小管上皮细胞;免疫荧光结果细胞CK18表达呈阳性,Vimentin和CD31呈阴性表达;qRT-PCR和Western blot结果表明,DMOG组中的HIF-1α,TGF-β1,α-SMA在mRNA和蛋白水平均较对照组有极显著增加(P0.01),而E-cadherin的表达显著降低(P0.05);经药物干预后,细胞形态由铺路石样转变为长梭形,经鉴定长梭形细胞为间质细胞。本研究成功建立了牦牛肾小管上皮细胞的分离培养体系,并发现HIF-1α表达上调可以促进牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化。     

维生素C维生素B_1和维生素B_6对草金鱼抗缺氧能力的影响

为了探究维生素C、维生素B_1和维生素B_6对草金鱼抗缺氧作用的影响,笔者在水中溶氧量一定的条件下,把草金鱼分别置于不同质量分数的维生素C、维生素B_1和维生素B_6水溶液中进行密闭缺氧试验,观察记录草金鱼的缺氧存活时间。结果表明,在17±1℃水温下,不同质量分数的维生素C、维生素B_1和维生素B_6水溶液均可延长草金鱼的缺氧存活时间,质量分数为5.313 g/L、7.813 g/L和8.333 g/L的维生素C,质量分数为0.234 g/L、0.313 g/L和0.391 g/L的维生素B_1,质量分数为0.547 g/L、0.625 g/L的维生素B_6剂量组与对照组相比差异均极显著(P0.01)。说明适量的维生素C、维生素B_1和维生素B_6水溶液能增强草金鱼的抗缺氧能力。     

1α-羟基维生素D3对肉鸡生长性能及钙磷利用率的影响

试验通过日粮中添加1α-羟基维生素D3(1α-OH D3)研究其对肉鸡生长性能、胫骨质量、血浆钙磷含量、钙磷利用率等指标的影响.将1日龄120只罗斯308肉鸡公雏随机分为3个处理,每处理4个重复,每重复10只.1～21日龄肉鸡3个处理分别采食不同种饲粮:①基础饲粮;②基础饲粮+5 μg/kg 1α OH D3;③基础饲粮+10 μg/kg 1α-OH D3.在22～42日龄,3组肉鸡采食相同饲粮,Ca、非植酸磷和维生素D3分别为0.90％、0.35％和1 000 IU/kg.结果显示:①饲粮中添加1α-OH D3改善1～21日龄、22～42日龄和1～42日龄肉鸡体增重和采食量;②1α-OH D3增加21日龄和42日龄肉鸡胫骨重量、强度、长度、直径和灰分含量;1α-OH D3提高21日龄胫骨钙、磷含量;③1α-OH D3提高1～21日龄肉鸡钙、磷利用率,降低21日龄血浆磷浓度;④1α-OH D3没有显著改善21日龄和42日龄肉鸡皮肤和肌肉色泽;⑤1α-OH D3增加肉鸡小肠长度和重量.在低钙、低磷饲粮中,1α-OH D3改善肉鸡生长性能,增强胫骨质量,促进小肠生长,增加钙磷利用率.     

腹水综合征肉鸡肝组织缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和结缔组织生长因子(CTGF)的变化及复方中药对其的影响

为探讨缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在腹水综合征(ascites syndrome,AS)肉鸡肝组织的表达和复方中药对其的影响,将309羽7日龄罗斯肉鸡随机分为5组,空白组(常规饲养),模型组(9～11℃,饲料添加3%猪油和4%鱼粉,饮水添加0.12%NaCl),复方中药组(高、中、低剂量组)在模型组基础上分别给予2.0,1.0,0.5 g·(kg·d)~(-1)的复方中药。Masson染色观察35日龄肝脏病理变化及胶原纤维含量变化,荧光定量PCR和ELISA检测15,25,35,45日龄肉鸡肝组织HIF-1α、CTGF基因和蛋白表达水平。结果表明:与空白组相比,模型组肉鸡腹水心脏指数显著增加(P0.01),肝组织HIF-1α和CTGF基因及蛋白质表达水平显著增加(P0.01或P0.05);与模型组相比,各剂量复方中药组均可改善上述指标(P0.01或P0.05)。这表明AS肉鸡肝组织HIF-1α、CTGF参与肝组织纤维化病理过程,促进AS病理发生发展;复方中药能下调AS肉鸡肝组织HIF-1α、CTGF表达,有效防治AS。     

维生素C对肉鸡的主要作用

近年来的养鸡实践证明,饲料补充维生素C,可以弥补肉鸡日益增长的营养需要和有限的生物合成能力之间的差距,添加补充维生素C对肉鸡是十分有益的,主要作用表现在以下几个方面:一具有良好的抗应激作用     

氟西汀和5-羟色胺对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

为探讨5-羟色胺转载体(5-HTT)在肉鸡肺动脉高压综合征发病中的机制,采用MTT比色法、流式细胞术及Hoechst33258荧光染色法研究5-羟色胺(5-HT)和5-HTT抑制剂氟西汀对体外培养的肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖与凋亡的影响,发现氟西汀能够抑制5-HT促PASMC增殖的作用;氟西汀能明显促进PASMC的凋亡,但氟西汀和5-HT共同作用于细胞,PASMC凋亡率明显少于氟西汀单独处理组。表明5-HTT在调节肉鸡PASMC的增殖和凋亡方面起重要作用,有可能参与肺动脉高压肉鸡肺血管重构的形成。