多杀性巴氏杆菌血清型的快速鉴别

澳大利亚莫纳什大学的John Boyce博士等研制出一种可以准确快速诊断禽霍乱病原体多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）血清型的工具。这项新技术不同于以脂多糖（LPS）生物合成基因为基础的菌株,比先前Heddleston血清分型要准确得多。John Boyce博士解释说,在LPS生物合成基因的基础上,我们深信我们的mPCR能精确区分多杀性巴氏杆菌菌株（98％左右）。     

新疆石河子规模化牛场多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了确定石河子地区某规模化牛场出现呼吸困难、咳嗽、病牛消瘦甚至死亡的病因,本研究以病牛病变组织为研究对象,采用常规细菌分离鉴定和细菌16SrRNA序列分析来鉴定菌种,以及多杀性巴氏杆菌种特异性基因Kmt-1和各个荚膜血清型特异性基因(hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD)PCR扩增来确定细菌的血清型,同时应用纸片扩散法对分离细菌进行药物敏感性试验和小鼠感染试验。结果表明,从病变的肺组织中分离到1株菌落为灰白色、露珠状、不溶血,染色为革兰阴性球杆状细菌,生化鉴定结果符合巴氏杆菌特征,同时16SrRNA序列分析与NCBI上已公布的多杀性巴氏杆菌16SrRNA序列同源性在99%以上;对多杀性巴氏杆菌特异性基因Kmt-1以及各血清型特异性基因PCR扩增只扩增到Kmt-1和hyaD-hyaC特异性基因片段;分离菌株对链霉素、庆大霉素、卡那霉素耐药,对其他30种药物敏感,同时感染小鼠全部死亡。结果显示从病牛体内分离到1株毒力较强的血清A型多杀性巴氏杆菌。     

脂多糖修饰对革兰阴性菌毒力及外膜囊泡生物学特性影响的研究进展

脂多糖(LPS)是革兰阴性(G^-)菌的内毒素,刺激机体引发炎症反应,为细菌的一种毒力因子,主要存在于细菌细胞壁外膜上,也是外膜囊泡(OMVs)的主要成份。OMVs是细菌从膜上脱落下来的一种囊状结构,含有大量的LPS、外膜蛋白及其他成分,具有良好的免疫原性,被认为是最具潜力的亚单位疫苗。大多数LPS由类脂A、核心寡糖和O抗原多糖组成,这3个组分的合成影响着LPS的结构,继而影响细菌的毒力和细菌分泌OMVs的产量、毒性及免疫原性等生物学特性。论文主要对LPS的合成转运过程中结构修饰对G^-菌毒力及其OMVs生物学特性的影响进行综述,为革兰阴性菌致病机理研究及开发新型亚单位疫苗提供新思路。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因缺失株的构建及其在小鼠上的交叉保护性分析

hyaD为A型多杀性巴氏杆菌荚膜多糖合成相关基因,为探讨该基因对多杀性巴氏杆菌毒力及其免疫保护特性的影响,本研究利用同源重组方法,构建了牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株（PmCQ2）的hyaD基因缺失株（ΔhyaD）。结果发现,与野生株相比,ΔhyaD的荚膜产生量及其感染后在脏器中的细菌定殖量均显著下降,其毒力显著降低。细胞试验发现,ΔhyaD更易黏附于巨噬细胞,被吞噬数量显著多于野生株,致使巨噬细胞相关炎性因子表达显著上调。hyaD基因的缺失,可调控与荚膜合成、LPS合成转运、铁转运等相关的基因表达显著下调,促使相关保护性抗原基因表达显著上调。以制备的PmCQ2株和ΔhyaD株灭活苗免疫小鼠（加强免疫1次）,免疫后第21天分别采用同源和异源多杀性巴氏杆菌攻毒,ΔhyaD株免疫小鼠肺组织感染后24 h无明显或轻微病理损伤,对牛源A型、B型和F型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为100%、100%和80%,对兔源、猪源和禽源A型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为90%、100%、100%;而野生株PmCQ2除对牛源A型多杀性巴氏杆菌的保护率在80%以上外,对牛源B型和F型及兔、猪、禽源A型多杀性巴氏杆菌均无明显交叉保护作用。研究结果表明,hyaD基因可通过调控荚膜产生及毒力相关因子表达影响菌株毒力;hyaD基因缺失可调控相关交叉保护性抗原表达,赋予菌株交叉免疫保护特性。该研究为多杀性巴氏杆菌通用型疫苗的研发提供了参考。     

牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

为了确定12株牛源多杀性巴氏杆菌的血清型及毒力基因的携带情况,本研究采用PCR技术对12株牛源多杀性巴氏杆菌(pasteurella maltocida,Pm)进行荚膜血清型鉴定和6种毒力基因(tbp A、hgb A、hgb B、ptf A、pfh A、tox A)的检测,并对其序列进行比对分析。结果显示:12株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型;100%的荚膜血清A型Pm携带hgb A毒力基因和pfh A毒力基因;41.67%的荚膜血清A型Pm携带nan H毒力基因;58.33%的荚膜血清A型Pm携带ptf A毒力基因;而对于tbp A与tox A两种毒力基因在12株牛源荚膜血清A型Pm中均未检测到。     

羊源D型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为了确定石河子地区规模化羊场出现呼吸道症状死亡羊的细菌性病原,采用常规细菌分离鉴定方法、细菌16SrRNA序列分析以及多杀性巴氏杆菌特异性基因kmt,从病变肺组织分离鉴定细菌,利用5个荚膜血清型特异性基因确定其血清型,扩增分离株的16个毒力相关基因,分析分离菌致病性和对常用抗菌药物的耐药性。结果表明,从病羊的病变肺组织中分离鉴定到一株血清D型多杀性巴氏杆菌,具有较强的致病性;携带8个毒力相关基因,其片段序列与NCBI上己公布的多杀性巴氏杆菌参考株同源性在99%以上;分离株对青霉素、林可霉素、庆大霉素、复方新诺明耐药,对其他23种药物敏感。     

牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ.参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,合成引物,通过多重PCR扩增2株菌的种特异性基因和荚膜血清型特异性基因.选取Pm-HLJ的目标PCR产物进行克隆、序列测定、Blast搜索同源序列并且比较分析.结果显示,Pm-HLJ的kmt1基因片段全长460 bp,与GenBank中各血清型kmt1基因同源性均在96.6%以上;荚膜血清型A菌株特异性基因同源性为99.9%;而与其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因的同源性均低于50%.由此确认,分离的2株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型,这是我国A型多杀性巴氏杆菌引发牛出血性败血症的首例报道.     

多杀性巴氏杆菌鉴定与特性研究的分子生物学方法

多杀性巴氏杆菌是一种常见病原菌，其血清型众多（16种血清型），在毒力及流行病学等方面的生物学特性差异很大。分子生物学鉴定和特性分析方法能直接揭示其基因型上的差异，具有高灵敏度和可靠性。本文综述了多杀性巴氏杆菌的PCR、菌落杂交和16S rRNA基因测序等鉴定方法以及限制性酶切分析、核糖体分型、脉冲场凝胶电泳、PCR指纹等特性分析方法。     

牛源荚膜血清型A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其种特异性基因的序列分析

从病死牛组织中分离到4株致病菌,编号分别为P1、P2、P3、P4。经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌。参考多杀性巴氏杆菌16S rRNA和种特异性kmt1基因以及荚膜血清型基因A(capA)、B(capB)、D(capD)、E(capE)和F(capF)合成引物,利用多重PCR扩增16S rRNA、kmt1和荚膜血清型基因,对PCR产物测序并进行同源性分析。结果显示,P1～P4都扩增出了16S rRNA、kmt1和荚膜血清型A型基因的特异性目的条带;P1～P4的16S rRNA、kmt1、A型基因序列与Genbank数据库中的多杀性巴氏杆菌相应序列具有高度同源性(99.0%);P2、P3、P4间的16S rRNA基因同源性较高(99.0%),而P1与其它3株(P2～P4)同源性较低,P1～P4间的kmt1基因、荚膜血清型A型的同源性较高(99.0%)。说明本次分的4株病原菌P1～P4均为荚膜血清型A型多杀性巴氏杆菌。     

禽霍乱免疫研究动态

一、多杀性巴氏杆菌血清型对免疫的指导意义由动物体分离到的多杀性巴氏杆菌(PM)具有复杂的抗原结构,根据其荚膜抗原和菌体抗原的不同分为不同的荚膜型和组.禽PM的免疫原性主要取决于荚膜,但菌体抗原在免疫学的重要地位也不可忽视,现已知禽PM的荚膜型为A型,这种具有抗原活性的荚膜性质在新分离的、毒力强的菌种中可得到充分发育,经人工培养继代后易于丧失。     

用多重PCR方法快速鉴定多杀巴氏杆菌毒力型

革兰氏阴性细菌多杀巴氏杆菌组成的异型物种与多种动物疾病有关。根据荚膜抗原(capA、B、D、E、F)把分离株分成5群。最近,一种新型PCR方法被用来确定多杀巴氏杆菌感染和毒力基因(tbpA、pfhA、toxA、hgbB)之间存在的流行病学相关性。然而,这种方法既繁琐又费力。因此,本试验设计了可靠的多重PCR方法来快速检测多杀巴氏杆菌的毒力基因。用多重PCR方法检测分离自临床上各种健康和患病宿主的87株多杀巴氏杆菌中的每种毒力相关基因。用本试验改进和简化的多重PCR方法即可完成4种毒力基因的快速检测,而且该方法也可用于流行病学调查的快速检测。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜血清型鉴定

从病死母猪肺脏中分离到一株革兰氏阴性小杆菌,用生理生化鉴定、药敏试验、致病性试验和PCR鉴定方法对分离菌株进行鉴定,并用多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物对分离株的荚膜血清型进行鉴定。结果表明:本菌为猪多杀性巴氏杆菌,对多种抗生素高度敏感,对小白鼠有强致病性;PCR扩增16SrDNA基因获得1415bp片段,分离株的16SrDNA核苷酸序列与多杀性巴氏杆菌(AY078999)的同源性为99%,因此该分离菌株被鉴定为致病性巴氏杆菌,命名为YN20110122株;本菌分离株为荚膜A型血清型多杀性巴氏杆菌。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖(LPS)含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14d血清抗体达1∶64~1∶128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。     

1株鹦鹉源多杀性巴氏杆菌的鉴定

<正>多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)属于革兰阴性球杆菌,定居于家禽和野禽的鼻咽部,能引起宿主出血性败血症,发病率和死亡率都很高,但不同类型的家禽易感性不同。多杀性巴氏杆菌有5个荚膜血清型,分别为A、B、D、E和F,引起禽类动物的多杀性巴氏杆菌荚膜血清型多为A型~([1])。此外,有较多技术对多杀性巴氏杆菌进行分型,其中多位点序列分型技术(multilo-     

两株牛源荚膜A群脂多糖3型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

用北京、山东两奶牛场疑似牛出败的病死牛组织感染小鼠,小鼠死亡后取组织染色镜检、接种血清TSA和麦康凯培养基,分离到2株疑似多杀性巴氏杆菌,命名为Pm1和Pm2。经细菌培养特性及形态检验、多杀性巴氏杆菌种特异性PCR、荚膜A、B血清群特异性PCR、脂多糖基因分型PCR、荚膜A群透明脂酸抑制试验鉴定其为荚膜血清A群、脂多糖3型多杀性巴氏杆菌。将Pm1和Pm2回归小鼠证明有强毒力。本试验为国内荚膜A群多杀性巴氏杆菌的流行病学研究增添了一些新数据。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）灭活疫苗菌株，本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价，并进行了攻毒保护试验。结果显示，分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多，均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因；免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应，在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128，强毒攻毒后全部存活，而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明，Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株，其中Pm3作为首选株。     

多杀性巴氏杆菌毒力因子、免疫原及重要基因研究进展

多杀性巴氏杆菌可引起禽霍乱、猪萎缩性鼻炎等多种动物疫病,是重要的动物病原微生物之一。其基因组编码的多种产物在该菌的致病性及诱导免疫应答方面具有重要作用,已成为研究的热点。作者就国内外多杀性巴氏杆菌荚膜、外膜蛋白、脂多糖等毒力因子和免疫原及其相关基因的研究进展进行了简要概述。     

牛A型巴氏杆菌高、低毒力株LPS激活RAW264.7细胞TLR4信号通路的比较分析

本研究旨在比较牛A型多杀性巴氏杆菌高毒力株(PmCQ2)和低毒力株(PmCQ6)脂多糖(LPS)对小鼠巨噬细胞RAW264.7内TLR4信号通路的影响。选用体外培养RAW264.7细胞,经LPS刺激后检测细胞内TLR4信号激活及对TNF-α和IL-12p40表达的影响;并利用Western blot检测LPS对IκBα磷酸化及NF-κBp65活化的影响。结果显示,高毒力株LPS_PmCQ2和低毒力株LPS_PmCQ6分别刺激RAW264.7细胞后,均能显著提高TLR4的表达,并诱导细胞因子TNF-α和IL-12p40的分泌表达;LPS_PmCQ2和LPS_PmCQ6均能诱导IκBα磷酸化,促进NF-κBp65核转位,但二者没有显著差异(P>0.05)。本研究表明牛A型多杀性巴氏杆菌高、低毒力株LPS均能参与TLR4介导的小鼠巨噬细胞免疫应答,且二者对TLR4介导的IκBα-NF-κB信号通路的作用无显著差异,暗示牛A型多杀性巴氏杆菌对小鼠巨噬细胞的毒力与LPS无明显相关性,可能由其他毒力因子决定。     

兔多杀性巴氏杆菌病病原的生物学特性鉴定

针对病兔进行细菌分离培养、生化鉴定、血清型鉴定、纯粹性检验以及毒力试验等生物学特性鉴定,经染色镜检、生化试验确定该病原为兔多杀性巴氏杆菌,分离菌命名为BS株,染色特征、菌落特征、生化反应等均符合兔多杀性巴氏杆菌的特点,毒力较强。     

实验用家兔自然发生的巴氏杆菌病:多杀性巴氏杆菌菌体和脂多糖的化学及血清学研究

作者对从实验用家兔中分离到的10株多杀性巴氏杆菌的菌体和脂多糖(LPS)进行了化学和血清学分析。这些分离物中大多数的 LPS 与明尼苏达沙门氏杆菌(S.minnesota)9700中的 LPS 相比,前者具有更强的致热原性,尽管它们的的 ketodeoxyoctonate 含量仅为沙门氏杆菌的18%。用福尔马林——生理盐水溶液提取的菌体抗原作凝胶扩散沉淀试验,发现