奶山羊发情期与间情期卵巢中CircRNA差异性表达谱分析

circRNAs参与许多重要的生物过程,并作为miRNA的"分子海绵"发挥重要作用。目前关于卵巢中circRNA的种类、数量、功能及其对卵巢发育的调控机理研究报道很少。本研究以发情期与间情期的奶山羊卵巢为研究对象,通过样品提取总RNA后并对其进行处理之后制备整个文库的策略,利用IlluminaHiSeq进行高通量测序并进行分析、生物信息学方法,采用RT-qPCR等检测技术,研究了奶山羊发情期与间情期卵巢组织中差异的circRNA表达谱。结果表明,奶山羊发情期和发情间期卵巢组织中候选的circRNA有22,333个,可分为六类;奶山羊发情期卵巢相对发情间期有772个circRNA差异性表达,268个上调,504个下调;奶山羊卵巢组织中除了Y染色体,circRNAs在其他所有染色体上均广泛分布,大多数circRNA长度约为500nt。因此本研究对奶山羊发情期和发情间期卵巢组织中circRNA表达谱进行检测和分析,为进一步探索circRNA在奶山羊发情周期卵巢发育中的调控机理提供试验依据,也为提高奶山羊的繁殖率提供新的思路与方法。     

湖羊卵巢不同发育阶段的miRNA鉴定与分析

旨在分析不同发育阶段绵羊卵巢组织中miRNA的表达水平,了解miRNA表达及其调控机理。本研究采用转录组测序技术鉴定1和8月龄湖羊卵巢组织中的miRNA,运用生物信息学方法对差异表达的miRNA进行靶基因预测,并对靶基因进行GO和KEGG功能注释,筛选参与卵巢发育的miRNAs。结果显示,6个样品中检测到的已知miRNA个数分别为2 186、2 091、2 217、2 136、2 176、2 088,新miRNA的个数分别为613、567、668、640、662、450。筛选到701个差异表达novel miRNAs,38个差异表达已知miRNAs。对差异表达miRNAs的靶基因进行GO和KEGG分析,发现主要富集在血管内皮生长因子通路和卵巢类固醇生成等过程。对3个差异miRNAs进行qRT-PCR验证,与测序结果一致。oar-let-7b、oar-miR-29a、oar-miR-134-3p、oar-miR-541-3p等的靶基因富集在TGF-beta通路、卵巢卵泡生长等与卵巢发育相关的生物过程。oar-miR-148a、oar-miR-136的靶基因调控颗粒细胞增殖和类固醇生成,可能参与调控绵羊卵巢发育。     

营养诱导舍饲哈萨克羊非繁殖季节卵巢组织中miRNAs差异表达分析

旨在利用Solexa测序技术分析、挖掘营养诱导非繁殖季节绵羊发情期和乏情期卵巢组织micro RNAs(miRNA),为进一步研究特定miRNA参与非繁殖季节绵羊发情的分子调控机制提供理论基础。以不同营养水平饲喂的哈萨克绵羊作为研究对象,在非繁殖季节前后分别屠宰已鉴定的3只发情(EN)和乏情(AN)母羊,分别采集卵巢(O)组织,构建两个小片段RNA文库(OEN和OAN),进行高通量测序和生物信息学分析,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异表达的miRNAs在哈萨克羊卵巢中表达水平。结果显示,两文库分别获得8 665 978(发情期)和9 071 102条(乏情期)clean reads,且绝大多数小RNA序列长度为21~23nt。两文库相比较,发现有9个已知和104个未知miRNAs表达差异显著(P0.01)。利用qRT-PCR随机选择的6个显著差异表达的miRNAs进行验证,其表达水平和测序分析结果一致。KEGG通路分析表明,这些差异miRNAs的靶基因主要参与了甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,氨基糖和核苷酸糖代谢,精氨酸和鸟氨酸代谢及甘油磷脂代谢等营养调控通路。结合靶基因预测及通路富集分析,推测差异表达的miRNAs是通过营养代谢通路对绵羊的非季节性发情起重要作用。     

发情周期不同阶段KiSS-1和GPR54 mRNA在小尾寒羊卵巢上表达规律的研究

研究发情周期不同阶段KiSS-1和GPR54 mRNA在小尾寒羊卵巢中的表达规律,为从分子水平阐明小尾寒羊多胎性的奠定基础。将12只雌性小尾寒羊随机分为4组,分别处于发情前期、发情期、发情后期和间情期,每组3只,颈动脉放血致死后采集卵巢,采用实时荧光定量PCR技术研究发情周期不同阶段母羊卵巢上KiSS-1和GPR54基因的表达规律。结果表明:母羊发情周期各阶段卵巢上均有KiSS-1和GPR54基因表达;发情期母羊卵巢KiSS-1基因的表达量显著提高(P<0.01),比发情后期、间情期和发情前期分别提高了1.0、1.7倍和1.4倍,发情周期不同阶段GPR54基因在卵巢上的表达量无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,发情期母羊卵巢上KiSS-1基因的表达量极显著高于发情周期其他阶段,提示卵巢上KiSS-1表达可能参与母羊排卵过程的调节。     

3个候选miRNA在不同光周期绵羊垂体中的表达及潜在功能预测

季节性发情是限制肉羊生产效率的重要因素，然而，当前绵羊季节性发情的分子机制尚未解析。本研究旨在对季节性发情3个候选调控因子(oar-miR-127、oar-miR-200a和oar-miR-200b)进行表达水平及潜在功能分析，以探索其在绵羊季节性发情中的调控作用。根据序列信息对3个miRNA进行了靶基因预测，构建了miRNA-mRNA互作网络，并对靶基因开展了功能富集分析；利用qRT-PCR技术检测了oar-miR-127、oar-miR-200a、oar-miR-200b和共同靶基因在长短光照周期转换过程的表达水平。结果表明，oar-miR-127、oar-miR-200a和oar-miR-200b可分别靶向2 890、534个和451个靶基因，三者与靶基因形成了复杂的互作网络；这些靶基因显著富集到基因表达的昼夜节律调节等生物过程及胰岛素、甲状腺激素和GnRH等繁殖相关信号通路；3个miRNA在光周期转换过程中均呈现下调的表达趋势(在SP21高表达，在LP21低表达)，靶基因与3个miRNA呈相反的表达趋势，暗示其可能受到miRNA的负调控。以上结果说明oar-miR-127、oa...     

调控香猪繁殖候选miRNA筛选

研究旨在从香猪卵巢small RNA测序数据中挖掘调控香猪繁殖的microRNA （miRNA）,解析miRNA调控香猪卵巢功能及繁殖性状的分子机制,对于猪的遗传选育具有重要意义。研究选取发情期和间情期的香猪各4头,屠宰后取其卵巢组织,提取总RNA进行small RNA测序,利用生物信息学方法检测miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNA,预测差异表达miRNA靶基因,并对靶基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果显示,香猪卵巢组织中miRNA在染色体上呈不均匀分布,主要分布于1号染色体和X染色体上。香猪卵巢中共有627个已知猪miRNAs表达,其中有34个差异表达miRNAs,表达量前五的分别是miR-23、let-7i-5p、miR-103、miR-30e-5p和miR-1271-5p。GO功能分析结果显示,靶基因主要参与的生物学过程是细胞过程（cellular process）,主要分布于细胞（cell）,主要分子功能是结合（binding）;KEGG显著富集通路中,促性腺激素释放激素受体通路（gonadotropin-releasing hormone receptor pathway）、胰岛素样生长因子通路（IGF pathway）和表皮生长因子受体信号通路（EGF receptor signaling pathway）与卵母细胞的发育成熟相关,因此推测miR-23b、let-7i-5p、miR-103、miR-30e-5p和miR-1271-5p可能参与了香猪繁殖调控。本研究初步筛选出5个可能调控香猪繁殖性能的miRNAs,可为从分子水平提高香猪产仔数提供理论基础。     

INHβB、FSHR和LHR在牦牛不同生殖生理阶段卵巢组织中的表达及差异性分析

为了从受体角度研究抑制素(INH)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)对牦牛不同生殖生理阶段卵巢发挥的功能,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白印迹技术(Western blot)和免疫组织化学技术(IHC)检测抑制素受体(INHβB)、促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在牦牛发情期、间情期和妊娠期卵巢组织中的表达和定位。结果显示,INHβB在妊娠期牦牛卵巢组织中的表达量显著高于发情期和间情期(P<0.05),而FSHR在发情期的表达量显著高于间情期和妊娠期(P<0.05),LHR则在间情期的表达量显著高于发情期和妊娠期(P<0.05);这3个受体主要分布在卵泡颗粒细胞、卵丘细胞、黄体细胞和卵泡膜上。结果表明,INHβB、FSHR和LHR在牦牛发情期、间情期、妊娠期卵巢组织中均有表达,但其表达量存在一定差异,提示INH、FSH和LH在牦牛不同阶段对卵泡生长发育、卵泡成熟、排卵及黄体的形成发挥着不同的作用,该结果为进一步研究牦牛生殖活动中INH与FSH、LH的互作机制提供参考。     

绵羊AA-NAT基因mRNA表达与常年发情相关性研究

为了探讨AA-NAT基因表达与绵羊常年发情之间的关联性,本研究以常年发情小尾寒羊和季节性发情滩羊各9只为研究对象,利用real-time PCR技术检测AA-NAT基因在这2种绵羊不同发情阶段下丘脑、垂体、松果体、卵巢、子宫体和肾上腺6种组织中的mRNA表达情况。结果显示,AA-NAT基因在不同情期的两个绵羊品种的6个组织中表达有明显差异,在发情期绵羊的卵巢、子宫体、松果体中高水平表达。春秋季发情期小尾寒羊与秋季发情期滩羊相比,其卵巢和子宫体中AA-NAT基因表达量极显著偏低(P0.01),而松果体中表达量极显著偏高(P0.01)。本研究结果初步表明,卵巢、子宫体和松果体中AA-NAT基因表达上调可能与小尾寒羊常年发情相关。     

蛋鸡繁殖性能相关长链非编码RNA的筛选与鉴定

该研究通过对比蛋鸡不同生长发育阶段卵巢组织,筛选鉴定与蛋鸡繁殖性能相关的长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。通过提取20周龄(n=3)、30周龄(n=3)京红蛋鸡卵巢组织总RNA构建测序文库,利用RNA-seq技术及生物信息学分析方法鉴定差异表达lncRNA并进行qRT-PCR验证及功能富集分析。在不同周龄蛋鸡卵巢组织中共筛选鉴定到1 283个lncRNA表达,其中10个存在差异表达,qRT-PCR验证了测序结果。差异表达lncRNA显著富集到190条GO条目及5条KEGG通路中。研究结果表明lncRNA参与蛋鸡繁殖性能调控相关的生物学过程、细胞组分、分子功能以及多种信号通路。     

猪GV/MⅡ期卵母细胞miRNAs表达谱及Npm2基因相关miRNAs筛选

旨在探索体外成熟前后猪卵母细胞miRNAs表达谱，并筛选参与调控Npm2基因表达的miRNAs。本试验回收屠宰场猪卵巢，收集GV期卵母细胞，经体外成熟培养后获得MⅡ期卵母细胞，分别提取约130个GV期和MⅡ期卵母细胞总RNA进行Illumina HiSeqTM 2500测序，获取miRNA测序数据，每个处理重复3次，筛选差异表达microRNAs并进行靶基因GO和KEGG聚类分析。结果表明，本研究成功构建了GV期和MⅡ期猪卵母细胞miRNAs表达谱，GV期和MⅡ期卵母细胞差异表达miRNAs有95个，具有相似表达模式的miRNA聚为一类，对95个差异表达miRNAs进行靶基因预测，共得到3 967个靶基因，经GO和KEGG富集分析表明，这些靶基因被富集于5 194个GO条目和212个信号通路，其中参与卵母细胞减数分裂成熟的信号通路有2个。在差异表达miRNAs中筛选到5个与Npm2基因相关的miRNAs。采用qRT-PCR对其中2个miRNAs进行验证，证实其表达趋势与测序结果一致。本研究筛选了GV期和MⅡ期卵母细胞差异表达miRNAs，推测差异表达的miRNAs可能通过代谢、卵母细胞减数分裂相关通路、孕激素介导的卵母细胞成熟通路等途径在卵母细胞体外成熟过程中发挥作用，并筛选出调控Npm2基因表达的miRNAs，研究结果可为进一步阐明miRNA对Npm2基因的调控及其在卵母细胞成熟过程中的作用提供依据。     

小尾寒羊高繁殖力候选基因ESR在同期发情处理过程中的表达分析

试验选择高繁殖力小尾寒羊为试验动物,采用公认的CIDR结合外源激素处理使其同期发情,与自然发情及乏情的小尾寒羊作对比,利用反转录荧光定量RT-PCR和Western blotting技术研究雌激素受体(estrogen receptor, ESR)基因在卵巢细胞中的表达差异,同时对其启动子区的甲基化岛进行了分析。结果发现,自然发情绵羊和外源激素处理发情的羊在发情表现和时间上无明显差别;在转录水平的检测结果上也无显著性差异(P＞0.05);但是它们显著高于在乏情期绵羊卵巢细胞内的表达(P＜0.05)。尽管激素处理的同期发情羊卵巢细胞内的ESR蛋白表达量显著高于乏情期绵羊,但是仍然显著低于自然发情期绵羊卵巢细胞的表达(P＜0.05)。此外,自然发情和激素处理的绵羊ESR基因启动子区CpG岛甲基化水平分别为0和10.77%,而发情期绵羊ESR基因启动子处于超甲基化状态（92.30%）。以上结果说明,外源激素处理的同期发情小尾寒羊尽管发情表现、时间等与自然发情的绵羊类似,但是ESR基因在蛋白水平上差异显著,且其启动子区CpG岛甲基化水平也存在显著性差异,这也许是目前胚胎移植后着床率低下的原因之一。     

BAD基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢表达规律及对生殖激素的影响

本实验研究旨在探究BAD基因在敖汉细毛羊中的不同发情时期卵巢中表达量的变化规律以及对生殖激素的影响,为探讨其与绵羊发情的关系奠定基础。首先利用放射免疫方法测定敖汉细毛羊血液中促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E_2)和孕激素(P_4)的浓度,然后利用qRT-PCR检测乏情期、发情前期、发情间期和发情期卵巢BAD基因的表达量变化。结果表明:卵巢中BAD基因在发情前期的表达量极显著高于乏情期、发情期和发情间期(P0.01),在发情期的表达量极显著高于乏情期和发情间期(P0.01),乏情期和发情间期的表达量基本相同(P0.05);E_2和LH浓度在BAD基因表达量最高的发情前期维持较高水平,P_4的浓度维持较低水平。综上可知,BAD基因的表达可能促进了E_2和LH浓度升高,抑制了P_4产生,进而影响细毛羊发情,可为绵羊发情的研究提供借鉴。     

德州驴与泌阳驴睾丸组织mRNA与microRNA表达鉴定与分析

试验旨在探究驴睾丸组织中mRNA和microRNA的表达模式,为中国地方驴的转录组研究提供遗传数据。利用RNA-Seq和生物信息学方法分析了中国地方驴睾丸组织表达基因和microRNA,并分析了泌阳驴和德州驴品种间差异表达基因及microRNA。结果表明,mRNA平均clean reads为57 837 506条,Small RNA平均clean reads为9 952 015条,分别占原始数据的96.34%和88.86%。在驴睾丸组织中共发现24 751个表达基因及1 074个表达microRNAs,其中,睾丸组织表达量较高的基因为LOC106836782、XLOC_066401、HSP90AA1、TNP1和COF2,表达量最高的microRNAs为eca-miR-143、eca-miR-21、eca-miR-99a、eca-miR-148a和eca-miR-26a。对泌阳驴与德州驴睾丸组织进行差异表达分析共发现102个差异表达基因及2个差异表达microRNAs,但未富集到功能条目,说明泌阳驴和德州驴品种间差异不明显。本研究提供了驴睾丸组织mRNA及microRNA表达模式和转录组学数据,并鉴定了泌阳驴与德州驴睾丸组织的差异表达mRNA和microRNA,对驴的遗传资源研究具有一定的科学意义。     

乏情和发情初产母猪卵巢microRNA差异表达分析

为了探索卵巢microRNA(miRNA)在初产母猪生殖调控中的作用,本研究利用Illumina高通量测序技术检测了乏情和发情初产母猪卵巢miRNA的表达谱,并对表达量较高且差异显著的miRNA进行生物信息学分析。结果显示,本研究构建的两个small RNA文库共鉴定出503个miRNAs,其中已知的303个,新预测的200个。在已知的miRNA中,ssc-miR-10b在两个文库中的表达量最高,其次为ssc-miR-143-3p和ssc-miR-26a;在新预测的miRNA中,chr13_2637_mature在两个文库中的表达量最高,其次为chr8_9994_mature。与发情母猪相比,共有145个miRNAs发生显著变化(read counts10,∣log2(fold-change)∣1),上调114个,下调31个。在进一步筛选的31个表达量较高且差异显著的miRNAs(read counts1 000,∣log2(fold-change)∣1)中,新预测的chr13_2585_mature上调倍数最高,且只在乏情母猪卵巢中表达。31个miRNAs共预测到7 388个靶基因,KEGG信号通路分析显示,有2 788个靶基因注释到了297个KEGG通路,前20个最富集的通路部分与生殖过程或生殖活动调控相关,表明这31个miRNAs参与了初产母猪的生殖调控。本研究结果丰富了猪miRNA数据资源,为进一步深入研究初产母猪的繁殖性能提供了理论依据。     

SHU 9119对小鼠发情周期中Ghrelin表达的影响

为了研究SHU9119与ghrelin之间的潜在的生理学关系,本试验选择4周龄的C57BL/6小鼠下丘脑和卵巢组织为研究材料,对小鼠发情周期中SHU9119介导的ghrelin mRNA在下丘脑和卵巢部位表达水平进行研究。结果表明,正常生理条件下小鼠间情期下丘脑保持较高水平的ghrelin mRNA表达,而在卵巢内其表达水平相对较低;腹腔注射SHU9119(50μg/kg体重)可极显著抑制下丘脑中ghrelin mRNA的表达(P<0.01),同时显著促进小鼠间情期卵巢Ghrelin mRNA的表达(P<0.05)。然而,SHU9119并未引起小鼠发情前期、发情期和发情后期ghrelin mRNA表达量的显著差异。上述结果表明,SHU9119可能通过MC4R系统调节间情期小鼠ghrelin的变化,而不参与其他性周期ghrelin mRNA表达量的相关调控。     

不同BMPRIB基因型小尾寒羊发情期ERα和PR表达量的研究

小尾寒羊BMPRIB基因上存在一个与多胎有关的突变位点,根据该突变位点采用PCRSSCP进行基因分型,利用半定量PCR技术研究发情期小尾寒羊BMPRIB基因型(BB,AB和AA)与ERα和PRmRNA表达量的关系结果显示:在发情期BB型右侧卵巢ERαmRNA水平(0.48)高于AA(0.27)和AB(0.24)型,但左侧卵巢则是AA(0.56)型高于AB(0.40)和BB(0.39)型;BB型右侧卵巢PR的mRNA水平(0.82)也高于AA(0.37)和AB型(0.20)而左侧卵巢各基因型基本无差异。这表明小尾寒羊多胎可能与PRmRNA表达量有关。     

乏情和发情初产母猪下丘脑-垂体轴中miRNA表达谱比较分析

【目的】从神经内分泌系统揭示微小RNA(microRNA,miRNA)调控初产母猪情期活动的遗传机制。【方法】利用RNA-Seq技术对乏情和发情初产母猪下丘脑-垂体轴中的small RNA进行测序,获得了母猪下丘脑和垂体miRNA表达谱,并对筛选的差异表达miRNA进行GO和KEGG等功能分析。【结果】从所构建的4个文库中共鉴定出1 096个miRNAs,其中已知miRNAs 364个,新预测miRNAs 732个。以发情母猪为对照,在乏情母猪的下丘脑有16个miRNAs存在差异表达,其中6个上调,10个下调;在乏情母猪垂体有9个miRNAs存在差异表达,其中2个上调,7个下调。下丘脑中16个差异表达miRNAs共预测到5 212个靶基因,垂体中9个差异表达miRNAs共预测到6 897个靶基因。下丘脑中靶基因主要在细胞投射组装、质膜结合的细胞投射组装、神经元投射发育的负调控、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等GO条目及Ras信号通路、神经营养因子信号通路、ErbB信号通路、mTOR信号通路等KEGG信号通路中显著富集;垂体中靶基因主要在mRNA加工调控、Ras GTP酶结合、泛素样蛋白连接...     

发情周期不同阶段牦牛子宫中黄体生成素受体的表达变化

为研究发情周期不同阶段牦牛子宫中黄体生成索受体(LHR)的定位及表达变化,笔者利用免疫组织化学SP法分别检测发情期、发情后期、间情期和发情前期牦牛子宫中LHR的表达,并进行光密度值分析.结果表明,LHR免疫阳性产物在牦牛子宫腺上皮细胞、基质细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和肌层平滑肌细胞中均有表达;腺上皮细胞、基质细胞和肌层平滑肌细胞中LHR在发情前期和发情期表达最弱,发情后期表达增加,间情期表达最强(P＜0.05);子宫内膜血管平滑肌细胞中LHR的表达在发情期最强,间情期最弱(P＜0.05);血管内皮中LHR在发情期和发情前期表达很强,发情后期和间情期显著下降(P＜0.05).结果表明LHR参与了发情周期不同阶段牦牛子宫功能变化的调控.     

Smad2基因在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中的表达分析

Smad2基因是Smads蛋白家族的成员之一,Smad家族中的信号分子对绵羊的繁殖、卵泡发育有重要影响。本实验选取24只3~4岁健康空怀敖汉细毛羊,采用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学技术,测定Smad2基因在绵羊不同发情时期(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)的表达量并分析其在卵泡中表达规律。结果表明:Smad2基因m RNA和蛋白均在绵羊发情前期表达量最高,m RNA水平极显著高于乏情期、发情间期和发情期(P0.01);而发情前期蛋白水平极显著高于乏情期和发情期(P0.01),虽高于发情间期,但差异不显著(P0.05);Smad2蛋白主要在卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞以及卵母细胞表达。据此,Smad2基因可能会促进敖汉细毛羊的发情启动。     

同源克隆筛选小尾寒羊繁殖性状候选基因

以构建的小尾寒羊卵巢组织cDNA文库为基础,利用最新的生物信息数据资料,采用同源克隆的策略,以已知其他物种与排卵率相关基因片段标记的探针对小尾寒羊发情期卵巢组织cDNA文库进行筛选、克隆,获得小尾寒羊卵巢组织特异表达的与排卵有关的基因ESTs,从而得到小尾寒羊与繁殖性状相关的新的候选基因。