火鸡疱疹病毒种毒的保存期试验

火鸡疱疹病毒种毒的保存期试验李慧姣孙荣改吴贤福缪从容刘效文李启红中国兽药监察所,北京１０００８１收稿日期：１９９７－０９－１８根据中华人民共和国兽用生物制品规程（１９９２年版）规定,鸡马立克氏病冻干疫苗的毒种（火鸡疱疹病毒ＦＣ－１２６株）在－１５℃以...     

火鸡疱疹病毒转移载体的质粒的构建

本试验采用以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β—半乳糖苷酶(LacZ)基因作为报告基因,将其插入到含有火鸡疮疹病毒(HVT)糖蛋白A(gA)抗原基因的克隆片段中,构建成HVT转移载体质粒,在该转移载体质粒中,大肠杆菌LacZ基因的两端分别与两段1.4kb和1.8kb的HVT同源片段相连,克隆于pUC19质粒中,将含有LacZ基因的载体质粒与感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取的全细胞DNA共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,用含有X-gal的琼脂糖覆盖细胞单层,可见到有兰色的病毒蚀斑,这些结果表明外源性的LacZ基因已被重组到HVT DNA中,同时还证明HVT的gA基因与HVT的复制无关,可以用于外源基因的插入和表达。     

火鸡疱疹病毒FCFC126株gB启动子的克隆与鉴定

启动子在重组火鸡疱疹病毒(HVT)载体疫苗中起着至关重要的作用,内源性启动子活性较弱,受载体病毒自身的复制调控。研究通过预测分析HVT(FC126株)囊膜糖蛋白(g B)启动子,将其克隆并与经密码子优化的H7N9亚型禽流感病毒的HA基因构建表达盒质粒,再进一步通过间接免疫荧光试验和荧光定量PCR比较其与外源性强启动子CMV和马立克氏病病毒(MDV,CVI988株)g B启动子的转录表达活性。结果表明:3种启动子均能使目的基因在体外获得转录表达,CMV启动子的活性高于内源性g B启动子,而HVT的g B与MDV的g B表达活性差异不显著。研究结果为重组HVT载体疫苗启动子的选择提供了一定参考。     

家蚕微孢子虫细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。     

免疫鸡羽毛根中火鸡疱疹病毒的分离与鉴定

用常规剂量的商用火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）冻干苗经腹腔免疫１日龄非免疫鸡,于第３周采集羽毛根,分别采取直接法和间接法（即经过滤获取脱细胞的游离物）接种次代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）,以进行病毒的分离。结果显示,在免疫后第３、４、５、６周,２种方法都分离到病毒,第７周仅直接法分离到病毒,而第８周２种方法都没有分离到。根据分离到病毒的细胞病变（ＣＰＥ）特征,结合地高辛标记的Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ－１）核酸探针检测结果,表明ＨＶＴ免疫鸡羽毛根中含有可脱离细胞的、具有感染性的疫苗株ＨＶＴ粒子,且其可检出时间具有阶段性。     

细菌人工染色体技术研究进展

细菌人工染色体是一种新发展起来的DNA栽体系统,它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点.在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用.笔者综述了近年来发展起来的对BAC进行分析和修饰的一些方法.     

火鸡疱疹病毒的新功用

火鸡疱疹病毒的新功用罗满林，蔡宝祥，陈溥言（南京农业大学，２１００１４）众所周知，马立克氏病（ＭＤ）曾给世界养禽业带来深重灾难，直到本世纪七十年代初，一系列以马立克氏病病毒（ＭＤＶ）为基础的疫苗研制和应用，才基本上扭转这种局面，尤其是应用最广泛的一种...     

绒山羊细菌人工染色体BAC文库构建条件的优化

近年来,细菌人工染色体BAC文库成为应用最广泛的基因组文库之一,它以其容量大、遗传特性稳定、嵌合体少、插入片段易回收、操作简便等不可比拟的优点而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究之中。作者就细菌人工染色体BAC文库的构建条件进行了研究,用HindⅢ部分酶切绒山羊基因组,脉冲场凝胶电泳分离大片段DNA,以电洗脱法回收DNA后,与BAC载体连接,将连接产物点透析后,电转化DH10B感受态细胞,最后对转化的片段小提质粒进行NotⅠ酶切,脉冲电泳鉴定其大小。结果表明,本试验采用的方法既可获得较大的插入片段又可获得较高的转化效率,是较好的用于构建大基因组文库的方法。     

编码基因完整的伪狂犬病毒细菌人工染色体的构建

为了构建包含伪狂犬病毒(PRV)完整编码基因的细菌人工染色体(BAC),首先对PRV基因组进行了分析,确定了单一酶切位点AcclⅠ,用PCR方法扩增出上下游同源臂、EGFP表达盒并同BAC质粒一起克隆到p UC_(18)质粒,获得转移载体;将经限制性内切酶AcclⅠ处理过的病毒全基因组连同转移载体共同转染BHK21细胞,获得重组病毒;利用PCR检测、电镜观察及生长曲线测定对野毒与重组毒的基本特性进行了比较。结果表明:重组病毒可以稳定地表达绿色荧光,BAC在传代过程中能够稳定存在;重组病毒在电镜下的形态与野毒未见差异,其生长曲线也基本同野毒吻合。说明成功构建的编码基因完整的PRV细菌人工染色体可用于该病毒的结构生物学及致病机理研究。     

猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株细菌人工染色体的构建与鉴定

为构建猪源伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA的细菌人工染色体(BAC),本研究将转移载体pHA2-pUC19-H1-H2的DNA与PRV AH02LA株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,利用转移载体中的GFP为筛选标记,获得携带GFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV-AH02LA(gE-/gI-)-pHA2。提取纯化的该重组病毒DNA转化E.coli DH10B,对获得的阳性克隆命名为BAC~(PRV-G)。提取BAC~(PRV-G)的DNA,将含gE、gI和其上下游同源片段的DNA与BAC~(PRV-G)的DNA共转染CEF,获得gE、gZ基因恢复的病毒命名为PRVAH02LA~(Rec)。比较亲本株PRV AH02LA、基因缺失株和恢复株的生长动力学,结果表明,恢复株的生长特性与亲本株无显著差异。本研究成功构建了PRV变异株AH02LA的BAC,并证实其为全基因组的感染性克隆,为PRV变异株的致病机理研究和新型疫苗研制提供了重要的平台。     

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，用设计带有限制性酶切位点的特异地扩增子人起始密码子开始的１．８ｋｂ新城疫病毒（ＮＤＶ）血凝素－神经氨酸（ＨＮ）基因开放式阅读框（ＯＲＦ），然后插入ｐＴＫ２Ｂ的Ｎｂｅ１位点，构建了含ＮＤＶＨＮ基因的插入载体ＰＴＫＨＮ１和ＰＴＫＨＮ２，将其与感染火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）细胞的总ＤＮＡ共转民纤维细胞（ＣＥＦ），经有限稀释法和Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ筛选，得到含有ＨＮ基因的重组体ｒＨ     

一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定

本实验对患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定,将表现典型锦锂疱疹病毒(KHV)病症状的鲤鱼肾细胞与单层框镜鲤鱼鳍细胞(KFC)共培养,5d～6d后出现典型的KHV细胞病变,即细胞体积增大并出现空泡化;在电镜下观察到典型的KHV病毒粒子;并应用PCR方法扩增获得KHV ORF25基因的849bp基因片段,连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的3株KHV同源性均为99.9%,命名为KHV-cj.基因进化比较显示,与KHV-J株关系较近.将病毒培养物(10-6.75TCID50)腹腔注射接种实验鱼可使其100%发病,并且症状和病理变化与自然感染KHV的鱼一致,死亡率为75%.表明本研究在国内首次分离到KHV.     

抗火鸡疱疹病毒特异性血清的制备与检测

抗火鸡疱疹病毒(Turkey herpes virus,HVT)特异性标准血清是鸡HVT活疫苗成品和毒种鉴别检测以及外源病毒检测中常用的标准品。为了制备检测用抗鸡HVT特异性血清,研究选取200只2周龄SPF鸡进行了针对HVT的基础免疫和加强免疫,于第四次免疫后21d采血分离血清,血清经混合、分装、冷冻真空干燥后,按照《中国兽药典》(2015年版)对其进行了性状、细菌、支原体、外源病毒、效价、特异性、剩余水分和真空度检测。结果表明,制备的抗HVT血清特异性良好,其中和效价为1:8,其他各项检测均符合《中国兽药典》(2015年版)规定,可应用于鸡HVT活疫苗成品或毒种的外源病毒检测以及鉴别检测,制备和检验流程对其他禽源病毒阳性血清的制备也具有一定的参考价值。     

细菌人工染色体荧光原位杂交技术的应用

目前,覆盖人类、植物、畜禽、微生物等100多种物种全基因组的细菌人工染色体文库在不同时间、不同群体中相继产生,为物种基因资源的保存、基因组学和后基因组学的研究提供了可靠的材料。细菌人工染色体与荧光原位杂交技术的结合能够将物种的大片段基因组DNA杂交在染色体上,确定基因或标记物在染色体上的物理位置,从而成为细胞和分子生物学领域中必不可少的工具。论文对细菌人工染色体荧光原位杂交技术在染色体结构与核型分析、疾病与肿瘤病原学研究、基因和标记物的定位与细胞遗传图谱绘制、基因组比较作图及物种进化中的应用和发展进行了综述。     

我国濒危家养动物细菌人工染色体基因组文库的构建及应用

细菌人工染色体(BAC)是新近发展起来的一种载体系统,具有克隆容量大,遗传特性稳定,转化效率高,易于操作等优点.在基因组文库构建和基因的快速克隆等方面已得到广泛应用.濒危家养动物细菌人工染色体基因组文库构建的目的在于有效、永久保存和利用其基因资源、快速克隆重要经济和抗逆性状基因以及为广泛、深入开展分子生物学研究提供宝贵的材料.     

细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术

试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库的构建奠定基础。以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的HindⅢ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切。结果表明,HindⅢ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL)。该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC文库的构建。     

提高火鸡疱疹病毒疫苗效价方法的研究

将火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）接种于鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）后,用显微镜观察病变（ＣＰＥ）达５０％时添加等量的健康ＣＥＦ,继续培养至ＣＰＥ达８０％时收获培养物,此时病毒蚀斑数最高。