PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞后对Ⅲ型干扰素应答的调控

Ⅲ型干扰素(IFN-λ)是一种新发现的抗病毒因子,在天然免疫和获得性免疫应答方面具有多重功能;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后造成猪的免疫抑制状态,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的应答受到抑制,IFN-λ的应答情况还不清楚。为揭示PRRSV感染猪后IFN-λ的应答情况与调控机制,以期进一步揭示PRRSV抑制宿主抗病毒免疫应答的分子机理。利用PRRSV强毒与弱毒株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测IFN-λ在mRNA与蛋白水平的差异,并检测了不同非结构蛋白(NSP)对IFN-λ的调控作用。结果发现PRRSV感染PAM细胞后均在mRNA水平上诱导IFN-λ1和IFN-λ3表达上调,且IFN-λ3比IFN-λ1上调更明显;然而在蛋白水平上二者均为表达下调。人源IFN-λ3比IFN-λ1显示出更强的抑制PRRSV复制的作用,且对强毒株GSWW/15的抑制效果更明显。PRRSV NSP7b和NSP9转染PK-15细胞后能使IFN-λ3的mRNA上调表达,但蛋白水平无变化;而NSP7a对IFN-λ3的mRNA和蛋白水平均无影响,提示NSP7b和NSP9可能通过某种机制抑制IFN-λ3的应答。     

在猪肺泡巨噬细胞上Notch信号通路调控LPS诱导的炎性反应研究

Notch信号通路可以与TLR信号通路相互作用,协作调控炎性因子的产生以及巨噬细胞的激活.然而,在猪巨噬细胞上,Notcb信号通路是如何调控炎性反应的还不清楚.本研究以LPS/TLR4诱导炎性反应为模型,利用猪肺泡巨噬细胞来研究LPS处理对Notch信号通路的影响及Notch信号通路对LPS诱导炎性反应的调控作用.结果...     

PRRSV与PCV2体外共感染对猪肺泡巨噬细胞免疫学功能的影响

制备猪肺泡巨噬细胞,分别接种PCV2、PRRSV、PCV2 PRRSV(先接种PCV2,12h后接种PRRSV)、PRRSV PCV2(先接种PRRSV,12h后接种PCV2)、PRRSV/PCV2(同时接种)和对照组。接种后不同时间观察细胞病变(CPE),并用real-time PCR和IFA方法检测PRRSV和PCV2滴度,INF-α、INF-γ、TNF-α、IL-8和IL-10的mRNA。结果为:①PRRSV能在PAM中增殖,有CPE;PCV2在PAM中感染率较低,无CPE。②PRRSV对PCV2增殖无明显影响。PCV2先于或同时与PRRSV感染对PRRSV的复制具有抑制作用,而PCV2后于PPRSV感染,可促进PRRSV增殖。③PCV2单独感染PAM后能促进INF-α、INF-γ、IL-8和IL-10的大量表达,对TNF-α的表达量影响不大。④PCV2与PRRSV混合感染,尤其是PCV2后于PRRSV感染后,TNF-α、IL-8和IL-10的表达量与单感染组相比明显增加,而INF-γ的表达量明显受到抑制。实验结果表明,PCV2感染时间对PRRSV的增殖影响不同,PRRSV感染后如果再感染PCV2,可以明显促进PRRSV病毒增殖;两种病毒共同刺激了TNF-α、IL-8和IL-10的大量表达,抑制了抗病毒因子INF-γ的表达,从而可能抑制体液免疫和细胞免疫,加重了病理学免疫应答。     

PCV2感染后JAK-STAT信号通路的基因差异表达分析

JAK-STAT信号通路是阐明细胞因子生物学功能及病毒如何发挥作用的分子基础,但对于猪圆环病毒2型（PCV2）感染及病毒复制的作用机制,目前尚无报道。本研究采用PCR列阵方法,建立PK-15细胞JAK-STAT信号通路的功能分类芯片,分析JAK-STAT信号通路中所有已知的Jak和Stat家族成员、激活JAK-STAT信号通路的受体,以及与Stat蛋白相关的核辅助因子及共同活化因子、Stat诱导蛋白及该通路的负反馈调节蛋白等基因在PCV2感染后的差异表达情况,为进一步明确PK-15细胞JAK-STAT信号通路对病毒复制力和复制机制奠定基础。     

猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞生物学活性的影响

将猪圆环病毒2型（PCV2）BF株经口、鼻接种40日龄健康仔猪，在接种后不同时间宰杀，收集猪肺泡巨噬细胞（PAM），同时设立对照。用FITC—Annexin V／PI双染色流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测PAM凋亡现象，通过EA花环试验测定Fc受体数目，通过吞噬鸡红细胞试验测定吞噬功能，分析PCV2感染对PAM生物学活性的影响。结果显示，在整个试验期内2种方法均没有检测到PAM凋亡，表明PCV2感染不会诱发PAM凋亡。PAM的Fc受体数和吞噬鸡红细胞数的变化规律一致，与对照组相比，两者数量在接种后第3d明显下降，第7d有所回升，之后基本恢复，表明PCV2感染后PAM吞噬和清除病原的功能出现短暂下降。     

猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞受体数的影响

猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)是近年来被发现和认识的一种重要的猪传染病。PMWS主要侵害5~12周龄的仔猪,以进行性消瘦,生长发育迟缓,皮肤苍白和多系统病理损伤为特征。     

利用ICR小鼠模型对PCV2感染中TLR3信号通路的研究

为探究猪圆环病毒2型(PCV2)感染对TLR3信号通路及炎性细胞因子的影响,本研究将30只6周龄ICR雌鼠随机分成两组(感染组和对照组),腹腔接种PCV2b/YJ株,在接种后第7 d、14 d、21 d、28 d和35 d采集小鼠外周血及脾组织。以临床观察、脾组织PCV2基因拷贝、小鼠血清抗体效价、IL-10和TNF-α的mRNA水平等指标评估感染模型;荧光定量PCR检测小鼠脾组织TLR3、TRIF、IFN-β、Mx1的mRNA水平,western blot检测TLR3蛋白表达水平。结果显示:PCV2感染期间感染组小鼠无可见的临床症状,第7 d至35 d感染组小鼠脾组织PCV2基因拷贝数呈逐渐降低趋势,PCV2的IPMA血清抗体在感染后第7 d转阳、35 d达到最高,IL-10 mRNA在感染后第14 d起升高、维持高水平;TNF-αmRNA在感染后第21 d和28 d升高。在感染后第7 d和14 d感染组小鼠TLR3、TRIF mRNA和TLR3蛋白表达水平显著升高;IFN-βmRNA在感染后第7 d具有显著升高过程;Mx1 mRNA在感染后第14 d时有上调过程。本实验在建立PCV2b/YJ亚临床感染ICR小鼠模型的基础上,体内实验表明PCV2感染小鼠激活了TLR3信号通路。本研究为利用敲除小鼠模型阐明TLR3参与PCV2感染引发的免疫应答机制奠定了基础。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）与猪圆环病毒2型（PCV2）共感染40日龄健康大白仔猪，利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞（PAM）共刺激分子CD80一CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明，在感染后第3d和第7dCD80与CD86mRNA转录显著下调（P〈0．05），感染后第14dCD86mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80mRNA转录水平在第14d和第28d高于对照组，CD86mRNA转录水平在第28d高于对照组，两者在第42d均高于对照组，但无显著差异。证实，PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制，PAM的抗原呈递能力受到影响。     

低剂量RT对小鼠肺泡巨噬细胞TLR4信号通路的影响

取SPF级昆明小鼠进行RT雾化攻毒。攻毒后每隔一段时间通过BCA法测定小鼠支气管灌洗液BALF上清中总蛋白浓度,ELISA法测定小鼠BALF中致炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β浓度,利用RT-PCR检测小鼠肺泡巨噬细胞TLR4及其信号通路mRNA的表达情况。结果显示:小鼠吸入1/150LD50剂量雾化RT后,BALF上清总蛋白浓度增加,IL-1β、TNF-α浓度12h时达到最高值,IL-6浓度48h达到最高值。攻毒后12,24h时TLR4表达高于空白组,差异显著(0.01P0.05);12h时MyD88表达高于空白组,差异极显著(P0.01)。12h时IRAK-1、IRAK-4、TRAF6表达高于空白组,差异显著(0.01P0.05)。结果表明:小鼠吸入1/150LD_(50)剂量雾化RT,肺部发生炎症且肺泡组织通透性增加;低浓度蓖麻毒素攻毒后可刺激肺泡巨噬细胞TLR4及其信号转导通路下游MyD88、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4等相关因子mRNA的表达,主要通过MyD88途径引起肺部炎症反应。     

PCV2与PRRSV体外共感染对肺泡巨噬细胞系炎症反应的影响

为了探讨猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)共感染后调控炎症反应的机制,选用稳定表达CD163的PAM细胞系3D4/21,分别设PCV2、PRRSV、PCV2+PRRSV(接种PCV2后12 h接种PRRSV)共感染组和对照组,利用间接免疫荧光检测(indirect immuno fluorescene assay,IFA)方法检测PCV2和PRRSV在PAM-CD163上的阳性率,采用RT-PCR检测IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10表达量的动态变化。结果显示PCV2和PRRSV均能感染PAM-CD163;PCV2单独感染PAM-CD163,早期促进了IL-6、IL-8、IL-1β的表达,晚期促进IL-10表达;PRRSV单独感染PAM-CD163能在晚期促进IL-1β、IL-10的表达;与PCV2单独感染PAM-CD163相比,PCV2+PRRSV共感染促进了IL-10表达并且持续增加;与PRRSV单独感染PAM-CD163相比,PCV2+PRRSV共感染促使IL-6、IL-8、IL-1β的表达量较早出现增加,并且持续增加。可见两种病毒之间存在一定的相互作用,共同调节机体免疫系统。本研究结果有助于解析PRRSV与PCV2共感染调控炎症反应的机理。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺泡巨噬细胞天然免疫信号通路相关分子变化分析

利用蛋白质组学的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪肺泡巨噬细胞(pulmonary macrophage,PAM)后的蛋白质动态变化进行探讨,为阐明病毒感染后引起的复杂免疫学反应及为该病的防控提供理论依据。通过Label-free LC-MS/MS方法定量鉴定PRRSV感染PAMs后差异表达细胞蛋白质。结果显示,共鉴定出430个显著差异表达蛋白质,其中包括171个上调表达蛋白质和259个下调表达蛋白质,这些蛋白质与细胞抗病毒天然免疫及抗原递呈等相关。值得关注的是,许多上调表达蛋白质都富集在与天然免疫相关的NF-κB、MAPK及RIG-Ⅰ等信号通路上,包括STAT1/2、OAS1/2、Mx1/2、ISG15/20、IFIT1/2/3/5等;下调蛋白质主要富集在MHCⅠ和MHCⅡ分子相关信号通路上。荧光定量PCR和Western blot结果证实,PRRSV感染导致了STAT1/2、OAS1/2、Mx1、CD14、ISG和IFIT等的转录或表达,这为进一步阐述PRRSV的感染机制奠定基础。     

应用IIF和PCR方法对病猪肺泡巨噬细胞PRRSV、PCV2的检测

对66份2004年10月至2005年8月患呼 吸道疾病发病猪的肺组织进行PBS灌洗处理,获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM抹片,应用间 接免疫荧光试验(IIF)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV);同时提取PAM DNA作为模板, 应用PCR方法检测猪圆环病毒2型.结果在66份PAM中,26份PRRSV阳性,23份PCV2阳性,其中 8份同时检测出PRRSV和PCV2.以上结果表明,猪群中PRRSV和PCV2混合感染情况比较严重; 应用IIF和PCR方法可以在PAM中检测PRRSV和PCV2.     

蓝耳病病毒对猪肺泡巨噬细胞的影响

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,分布在机体各个组织中,具有吞噬、抗原加工与递呈、分泌及免疫调节等生理功能。猪感染蓝耳病病毒后,主要影响肺泡巨噬细胞的功能,表现为肺泡巨噬细胞数量减少,吞噬、杀菌活性下降,分泌功能受到抑制,抗原加工、递呈能力减弱等,直接造成感染细胞凋亡和附近大量非感染细胞凋亡,从而形成严重的免疫抑制。蓝耳病导致免疫抑制后,机体对其它病毒性疾病和细菌性疾病易感性明显增加。普清（替米考星）能直接进入到肺泡巨噬细胞内并保持较高的药物浓度,修复受损的肺泡巨噬细胞,恢复肺泡巨噬细胞的数量与吞噬能力等,解除免疫抑制状态,间接起到抗蓝耳病和继发感染的作用。     

用猪感染肺泡巨噬细胞诊断生殖—呼吸道综合征

用灌洗肺脏收集的肺泡巨噬细胞建立了检测活猪生殖－－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）感染的高效敏感方法。５头１０周龄（１头）和１４周龄（４）的猪，口鼻接种口接触感洒ＰＲＲＳＶ。感染ＰＲＲＳＶ前收集每头仔猪的诊断样品在以后９周内，每周采集一次血清。第２和第４－９周收集肺居噬细胞，血清和肺泡巨噬细胞均适于早期感染的检测，但时间稍长后肺泡巨噬细胞为更好。４时仅从１头仔猪血清中分离到病毒，而从４头仔狸的肺泡巨     

PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞IFITM3基因转录的影响

干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon inducible transmembrane proteins 3,IFITM3)作为抗病毒蛋白可以抑制多种病毒的感染,本研究针对猪IFITM3基因设计特异性引物,构建重组质粒并作为阳性标准品,建立了检测IFITM3基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法最低检出下限为10~2 copies/μL,且线性关系好(R~2≥0.997),敏感性高,特异性强,重复性好,批内、批间变异系数均小于3%。将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)细胞,在不同感染时间对细胞中IFITM3 mRNA进行检测。结果显示,PRRSV感染早期IFITM3转录水平保持不变,在感染后转录水平逐渐升高。IFITM3 mRNA在PRRSV感染PAM过程中转录变化,可能是PRRSV宿主免疫逃逸的机制之一。     

猪SERPINC1基因对PCV2复制的效应及其转录调控

旨在研究猪SERPINC1基因对PCV2复制的影响,并探究SERPINC1基因的转录调控。本研究以15头纯种的莱芜猪(LW)和15头大约克夏-长白杂交的商品猪(YL)为试验动物。每个品种分为2组:接毒组(10头)和对照组(5头)。对接毒组的猪肌肉注射3 mL 6.3×10~(-3) TCID_(50)的PCV2-SD毒株,对照组的猪肌肉注射3 mL的磷酸盐缓冲液。在前期转录组测序的基础上,分析SERPINC1基因对PCV2复制的效应,并分析检测SERPINC1基因启动子和转录活性。结果表明,过表达SERPINC1能显著抑制猪肺泡巨噬细胞(PAM)中PCV2的复制。分别克隆了LW和YL猪SERPINC1基因转录起始位点上游3 854 bp的序列,并进行启动子活性的分析,发现PCV2接毒后LW猪SERPINC1基因的启动子活性显著升高(P0.05),而YL猪的启动子活性无显著变化。在SERPINC1基因的5′调控区找到4个调控该基因转录的关键区段,并对上述关键调控区中的4个多态性位点对SERPINC1基因启动子活性的影响进行了分析。综上表明,这4个多态位点均不影响SERPINC1基因的启动子活性。该研究结果为找到与猪抗PCV2有关的基因及分子标记奠定了基础。     

甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激的影响

【目的】 探究甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞引发的氧化应激的影响, 为开发治疗副猪嗜血杆菌感染的新型药物提供参考。【方法】 利用支气管肺泡灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞, 分为6组: 阴性对照组, 未感染副猪嗜血杆菌的猪肺泡巨噬细胞; 阳性对照组, 感染副猪嗜血杆菌的猪肺泡巨噬细胞; DMSO组, 猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后给予0.1% DMSO; 5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组, 猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后给予相应浓度的甘草查尔酮A。各组细胞培养24 h后, 用CCK-8法检测细胞活力, 用酶标仪或可见光分光光度计检测各组细胞上清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)、一氧化氮(nitric oxide, NO)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)水平, 用活性氧(reactive oxygen species, ROS)荧光探针(DCFH-DA)检测ROS水平。【结果】 与阴性对照组相比, 副猪嗜血杆菌感染组猪肺泡巨噬细胞活力均显著降低(P<0.05), 上清液中LDH活性均显著提高(P<0.05), MDA、NO、ROS水平及SOD活性均显著增加(P<0.05);与阳性对照组相比, 5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞活力均显著提高(P<0.05), 上清液LDH活性均显著降低(P<0.05), 10和20 μg/mL甘草查尔酮A组MDA、NO和ROS水平均显著降低(P<0.05);5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A处理组GSH-Px、SOD和T-AOC活性均呈剂量依赖性显著升高(P<0.05)。【结论】 副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞导致氧化和抗氧化平衡失调, 5~20 μg/mL甘草查尔酮A可以降低细胞氧化应激反应。     

PMWS患病猪和健康猪感染的PCV2序列比较分析

根据GenBank中已发表PCV2全基因序列,设计1对特异性引物,建立扩增PCV2全基因的PCR方法。用该方法从山东、河北、安徽、甘肃4个省份的4份PMWS患病猪的阳性病料和山东德州、南京、北京、甘肃、甘肃泉州和白银5个屠宰场的7份健康猪阳性样品中直接扩增出11个PCV2全基因片段。将扩增片段克隆于pMD18-T载体,并通过双酶切的方法筛选获得了11个阳性重组质粒,分别命名为SDPCV、HBPCV、AHPCV、GSPCV、DZPCV1、DZPCV2、DZPCV3、NJPCV、BJPCV、BYPCV和QZPCV。测序结果分析表明,除了BJPCV和GSPCV2株PCV2基因组全长为1768bp外,其余9株基因组全长均为1767bp。应用DNAstar序列分析软件,对测定的11个PCV2序列与GenBank中登录的10个不同地区的代表毒株进行同源性比较,发现健康猪群感染毒株的全基因组序列和ORF2及其氨基酸序列同源性比患病猪群略高,ORF1、ORF3及其相应氨基酸序列同源性在2类猪群中则没有明显差异。系统发生进化树显示,DZPCV3与其他10株PCV2亲缘关系较远,但与山东分离株AY556473亲缘关系接近,共同构成一个独立分支;其余10株PCV2之间关系密切,都分布于一个独立的小分支中,并与法国分离株亲缘关系接近。患病猪群和健康猪群感染的PCV2在基因进化树上交错分布,表明2类猪群感染的PCV2在基因水平上差异不显著,在地域分布上也没有明显差异。     

人工感染的公猪PCV2 DNA阳性精液的传染性

猪圆环病毒2型（PCV2）是一种会造成重大经济损失的病原。用PCR可以检测到公猪精液中存在PCV2 DNA,然而其生物关系并不清楚。该研究的目的旨在确定：（1）给猪做生物测定,看PCV2 DNA是否有传染性;（2）当用PCV2 DNA阳性精液进行人工授精时有什么风险。     

人工感染的公猪PCV2 DNA阳性精液的传染性

猪圆环病毒2型（PCV2）是一种会造成重大经济损失的病原。用PCR可以检测到公猪精液中存在PCV2 DNA,然而其生物关系并不清楚。该研究的目的旨在确定：（1）给猪做生物测定,看PCV2 DNA是否有传染性;（2）当用PCV2 DNA阳性精液进行人工授精时有什么风险。