资兴市州门司镇口蹄疫血清学抗体监测与分析

为掌握资兴市州门司镇家畜口蹄疫的免疫状况与流行情况,对2016年州门司镇采集的126份牛、羊、猪血清样品进行O型口蹄疫抗体和口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的检测与分析。结果显示,资兴市州门司镇牛、羊、猪O型口蹄疫的免疫合格率分别为100%、100%、98.11%,牛、羊、猪口蹄疫野毒抗体阳性率均为0%。说明资兴市州门司镇家畜O型口蹄疫疫苗免疫效果整体较好,暂无口蹄疫病毒野毒株的流行。     

新型疫苗填补我国口蹄疫防控技术的空白

正近日,由中国农业科学院兰州兽医研究所与中农威特生物科技股份有限公司等联合研发的一类新兽药——猪口蹄疫O型A型二价灭活疫苗正式发布,该项成果填补了国家口蹄疫防控技术的空白,有力支撑了国家口蹄疫的防控工作。由于O型和A型口蹄疫在猪群中长期、反复流行,因此,猪用口蹄疫疫苗往往只能免疫一种病毒,针对性不强,疫苗稳定性及保护效力欠佳。"猪口蹄疫O型A型二价     

闽西地区猪流行性腹泻病毒N基因分子进化及序列分析

分析闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的遗传进化特征,收集闽西地区猪流性腹泻病例组织样品8份,用逆转录PCR(RT-PCR)扩增N基因,连接至pMD-18T载体进行测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果显示,8株闽西流行毒株之间N基因核苷酸的同源性为9.8%～100.0%,推导的氨基酸序列的同源性为99.5%～100.0%,而闽西毒株与早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性较远。氨基酸序列分析表明,闽西毒株氨基酸序列存在15处突变,与2010年后中国流行毒株变异位点相同。提示闽西地区毒株为目前国内流行毒株,与疫苗毒株亲缘关系较远,可能导致机体针对疫苗毒株产生的抗体不能够有效抵抗变异毒株,不能给猪群提供很好的免疫保护,因此需要基于变异毒株研究出有针对性的疫苗来预防PEDV。     

猪流行性腹泻弱毒疫苗研究进展

分析了我国猪流行性腹泻疫苗的使用现状,从疫苗毒株的选择、野毒株的分离和培养、毒株的致弱、疫苗安全性和免疫效力等方面综述了猪流行腹泻弱毒疫苗的研究进展,以期为新形势下进一步开展猪流行腹泻疫苗的研发提供借鉴与参考。     

嵌合猪瘟病毒基因Ⅱ型E2抗原区的重组C株病毒 构建及其生物学特性

【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗,但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高,因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗,为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上,拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2,并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热,兔脾脏肿大;重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少,在接种后第12天检测到一过性的病毒血症;对接种猪血清检测结果表明,针对2型毒株的相应抗体在接种后的20 d达到高峰;接种猪血清针对C株和HZ1-08毒株的中和抗体效价相当,但C株免疫猪血清对流行毒株的中和抗体水平降低。【结论】重组嵌合病毒RecCHZE2不仅保留C株病毒弱毒的特性,且可提高针对Ⅱ型流行毒株的抗体水平。     

猪圆环病毒3型研究进展

2016年,美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术,从患有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒,命名为猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)。流行病学调查发现PCV3感染多见于具有PDNS和繁殖障碍症状猪群,目前已于美国多个州猪群内普遍流行。同时,美国旧金山血液系统研究所科研人员从3头不明病因导致的心脏和多器官炎症仔猪体内也检测出PCV3。随后,我国湖北、广东等多个省市猪群中也检测出PCV3。近来,波兰和韩国相继报道存在PCV3感染猪群。作为一种新发现病原体,PCV3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。文章综述PCV3最新进展,以期为后续研究提供参考。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因,设计合成2对特异性扩增引物,用以扩增PEDV S基因和ORF3基因,通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型;通过对退火温度等反应条件的优化,建立了检测不同PEDV毒株类型的多重RT-PCR鉴别检测方法。结果显示,所建立的多重RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株;PEDV变异毒株扩增出2条目的条带,分别为234 bp的ORF3基因片段和826 bp的S基因片段;PEDV经典毒株扩增出1条目的条带,片段大小为234 bp的ORF3基因片段;而弱毒疫苗株扩增出1条目的条带,片段大小为185 bp的ORF3基因片段;与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒、猪细环病毒及猪细小病毒均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μl;且该方法具有良好的重复性。利用该方法对采集自广西部分地区的91份临床腹泻样品进行检测,样品中PEDV阳性样品有64份,其中变异毒株占89.06%(57/64),经典毒株占4.69%(3/64),弱毒疫苗株占6.25%(4/64)。结果表明,该多重RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株RT-PCR方法的建立

为临床上能鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株和疫苗株,根据GenBank中已发表的PEDV疫苗株ORF3基因序列,在245~293位缺失区域两侧设计合成1对特异性引物,建立了快速鉴别和诊断PEDV野毒株和疫苗株的RT-PCR方法,即PEDV野毒株、疫苗株基因组中分别可扩增出长度为282和233bp的特异性片段,而对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪博卡病毒、猪伪狂犬病毒核酸扩增均为阴性;对PEDV野毒株与疫苗株的最低检测下限分别为455拷贝/μL和396拷贝/μL。该方法不仅能够有效区分PEDV野毒株和疫苗株,而且能够鉴别发病猪的感染情况,为该病的防控提供了有效地技术保障。     

猪伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

【目的】进一步了解猪伪狂犬病毒新流行株的遗传特征。【方法】对从安徽某猪场分离的1株猪伪狂犬病病毒(PRV)AH株进行遗传进化分析及主要糖蛋白gB、gC、gD、gE的序列分析。【结果】PRV AH株与国内2011年以来的流行毒株非常相似,但与Bartha株及其他国外毒株遗传关系较远;国内流行毒株与Bartha株及其他国外毒株相比,其主要糖蛋白均存在明显的连续氨基酸的缺失和插入,且部分突变位点位于这些糖蛋白的重要功能区。【结论】从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株的遗传差异,为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据。     

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

猪圆环病毒2型不同基因型毒株感染性克隆的构建及拯救毒株的体外生物学特性

 【目的】中国猪群中猪圆环病毒2型（PCV2）感染存在不同基因型毒株(PCV2a、PCV2b和PCV2d),有必要阐明不同基因型PCV2毒株的致病性差异。【方法】采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。【结果】构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆,经转化细胞后拯救4个克隆毒株,经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代,病毒增殖能力稳定,毒价均可达到105.0TCID50•mL-1;用具有中和病毒活性的单克隆抗体（1D2株）进行抗原捕获ELISA检测,拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应,另3个克隆毒株（PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH）与该单抗均无反应,表明不同基因型代表毒株抗原性不同。【结论】中国猪群中PCV2流行毒株基因组及ORF2长度存在差异,其病毒抗原特性不同,构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株,为进一步研究其致病性差异奠定了基础。     

猪乙型脑炎病毒基因Ⅰ型弱毒株免疫小鼠后诱导INF-γ的能力

【目的】评估基因Ⅰ型猪乙型脑炎病毒弱毒株(SCYA201201株)作为候选疫苗诱发机体产生细胞免疫的能力。【方法】将基因Ⅰ型猪乙型脑炎弱毒株(SCYA201201株F122代次)腹腔免疫小鼠后使用ELISA检测试剂盒测定早期的INF-γ水平,之后测定INF-γ在小鼠体内的持续时间。【结果】结果显示:猪乙型脑炎SCYA201201弱毒株(F122代次)经腹腔免疫小鼠后,小鼠血清中的INF-γ在免疫后6 h就可上升到一个较高水平,且INF-γ在血清和小鼠脾脏淋巴细胞中均可持续14 d以上。【结论】猪乙型脑炎SCYA201201弱毒株(F122代次)免疫小鼠后能够在早期诱发INF-γ产生,并且能够维持14 d以上,有作为候选疫苗的潜力。     

贵州省几种猪繁殖障碍性疫病的血清学调查

采用乳胶凝集试验和间接ELISA试验,分别对贵州省部分地区种猪场和规模场猪群进行猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒及猪Ⅱ型圆环病毒抗体水平检测。结果:免疫猪群中猪细小病毒感染、猪伪狂犬病及猪繁殖障碍与呼吸综合征抗体阳性率分别为81.6%(124/152)、84.0%(221/263)和62.7%(406/648);非免疫猪群中猪细小病毒感染、猪伪狂犬病、猪繁殖障碍与呼吸综合征及猪Ⅱ型圆环病毒感染抗体阳性率分别为17.6%(79/449)、13.8%(61/442)、5.4%(19/352)和15.9%(83/519)。表明,猪细小病毒感染、猪伪狂犬病免疫效果比较理想,贵州省猪群中可能存在上述4种疫病的感染,应当引起养猪业的高度重视。     

A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列的测定及其基因特征分析

[目的]测定A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列并分析其基因特征,为研究我国最近发生的A型口蹄疫病毒的致病性、流行规律以及筛选适用的疫情防控疫苗株奠定分子基础。[方法]应用RT-PCR方法,分段扩增、克隆A/HeN/1/2009株基因,并进行基因测序;借助DNAStar分子生物学软件,从分子流行病学角度分析A/HeN/1/2009株与参考毒株之间可能的遗传衍化关系。[结果]该毒株基因组全长8 171 nts[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],其中5'-UTR和3'-UTR分别为1 080、92 nts,蛋白编码区为6 999 nts。分析A/HeN/1/2009株遗传衍化关系显示,该毒株划为东南亚拓扑型Laos03系的VN09亚系,同源性依次为87.3%～91.8%、93.7%～94.5%和96.9%～98.4%。[结论]VP1中A24V、N85R、S196T,3A中I61V、T128S、E147G和A134V在该毒群的进化过程中扮演重要角色;A/SH/1/2009株VP1 140-160基序为RSD。     

猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR鉴别

为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(PRV)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对g E、g B和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR检测方法。通过一次PCR检测能区分感染野毒株、疫苗株SA215和Bartha-K61,且与猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。多次试验证明该方法简单、可靠且敏感度高,可用于科学研究和临床诊断等方面。     

猪O型口蹄疫O/MYA98/BY/2010株灭活苗与合成肽苗免疫效果对比研究

通过监测湖南省娄底市娄星区4年的猪O型口蹄疫疫苗免疫抗体效果,对猪O型口蹄疫O/MYA98/BY/2010株灭活疫苗与猪O型口蹄疫合成肽疫苗在临床应用中的免疫效果进行比较性研究。结果表明:4年的猪O型口蹄疫疫苗抗体免疫合格率差异显著(p0.05),2014年使用O/MYA98/BY/2010株口蹄疫灭活苗免疫合格率最高,为89.3%;除2013年外,其余3年的疫苗免疫合格率均达到国家农业部规定的70%的要求;相应猪O型口蹄疫疫苗当年在不同养殖场中的免疫效果表现均有一定的差异,但各年的变异系数间差异不显著(P0.05),两种类型的疫苗在连续使用后出现不同程度的效力减退现象。     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。     

猪蓝耳病的防治措施

临诊症状该病的潜伏期差异较大,引入感染后易感猪群发生蓝耳病的潜伏期最短为3天,最长为37天。该病的临诊症状变化很大,且受病毒株、免疫状态及饲养管理因素和环境条件的影响。低毒株可引起猪群无临诊症状的流行,而强毒株能够引起严重的临床症状,临诊上可分为急性型、慢性型、亚临诊型等。     

猪蓝耳病的防治措施

临诊症状该病的潜伏期差异较大,引入感染后易感猪群发生蓝耳病的潜伏期最短为3天,最长为37天。该病的临诊症状变化很大,且受病毒株、免疫状态及饲养管理因素和环境条件的影响。低毒株可引起猪群无临诊症状的流行,而强毒株能够引起严重的临床症状,临诊上可分为急性型、慢性型、亚临诊型等。     

四川省猪流行性腹泻病毒SNJ-P株的分离鉴定与遗传进化分析

【目的】探究四川省猪流行性腹泻病毒(PEDV)毒株流行变异情况,并分析疫苗免疫效果不佳的原因。【方法】从四川某猪场采集仔猪肠道样本进行PCR检测、病毒纯化、病毒滴度测定以及病毒感染等试验;测定分离株全基因组序列,将分离株S基因序列与其他地区毒株及疫苗株进行比对并构建进化树;比较分离株与经典疫苗株CV777 S蛋白氨基酸位点变异情况。【结果】成功分离获得1株PEDV毒株,并命名为PEDV SNJ-P,该毒株病毒滴度为1×107.5/100μL。动物感染试验表明：分离株能引起仔猪出现腹泻和脱水等症状并导致死亡。全基因组测序及遗传进化分析表明：PEDV SNJ-P株全基因共28 003 bp,基因型为S non-INDEL型;与同型的中国分离株PEDV-WS、CH/JLDH/2016和CH/HNLH/2015等毒株亲缘关系较近,与同型的疫苗株亲缘关系相对较远,与经典疫苗株亲缘关系较远。与经典疫苗株CV777相比,SNJ-P株的S蛋白存在多处氨基酸突变、缺失和插入现象。【结论】由于毒株出现变异,SNJ-P株与疫苗株亲缘关系较远,当前所用疫苗无法提供有效保护。本研究结果以期为国内PEDV毒株的研...