陆川猪GPR1基因启动子甲基化及其mRNA表达分析

为了探讨G-蛋白偶联受体1(GPR1)基因启动子甲基化对其在陆川猪和杜洛克猪背最长肌组织中差异表达的影响,试验采用实时荧光定量PCR方法检测GPR1基因mRNA在两个品种猪背最长肌中的表达水平,在线预测的方法预测GPR1基因启动子区CpG岛,亚硫酸氢盐测序(BSP)法分析猪GPR1基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果表明:GPR1基因在两品种猪背最长肌组织中的相对表达量差异显著,在陆川猪背最长肌中的相对表达量明显高于杜洛克猪;GPR1基因启动子区存在一个CpG岛,长度为103 bp,位于-1 031~-929 bp处;GPR1基因启动子区CpG岛在两品种猪背最长肌中的整体甲基化水平差异不显著,但在-126,-116,-64,-10位点甲基化水平差异显著。说明GPR1基因启动子甲基化程度与肌内脂肪沉积存在一定关联。     

GPR54基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位研究

试验旨在研究GPR54(G-protein coupled receptor 54)基因在绵羊不同组织中的表达及其在4~6月龄公羔睾丸组织中的表达特性及定位。本研究采用实时荧光定量PCR法检测各组织GPR54 mRNA表达规律,以及其在不同月龄公羔睾丸中的表达量,运用免疫组化技术对睾丸中GPR54基因进行定位分析。结果显示,GPR54在不同组织中均有不同程度的表达,其中在下丘脑、垂体和睾丸中大量表达;GPR54在4~6月龄绵羊公羔睾丸组织中呈阶段性表达,6月龄表达量显著高于4和5月龄(P<0.05);4月龄时,在精原细胞和极少数的初级精母细胞中检测到较弱的阳性信号;6月龄性成熟时,在睾丸中分裂早期的精子细胞检测到强阳性信号。综上表明,GPR54基因在绵羊不同组织中广泛表达,在下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中发挥重要的作用,并与动物的性成熟及雄性动物精子发生过程有密切的关系。     

牛ATP5B基因启动子与组织差异性表达研究

本研究旨在检测前期构建的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒在3T3L-1细胞系中的表达活性,检测ATP5B基因在不同组织中的差异表达情况。经脂质体法转染3T3L-1细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶相对活性,结合生物信息学软件进一步确认牛ATP5B基因可能的核心启动子;利用试剂盒从秦川牛的16个不同组织提取RNA,反转录后,先检测cDNA,再设计ATP5B基因定量引物和1对β-actin内参引物,进行实时荧光定量反应,最后,结合软件比对不同物种的ATP5B基因近端启动子和氨基酸序列。结果,通过转染细胞和荧光素酶活性分析,统计学分析证实重组质粒pATP5B-462荧光素酶活性最高,软件分析所对应的启动子区域-547~-230bp存在TATA盒、CAAT盒、GATA盒、v-Myb、deltaE这些重要转录调控元件。牛的ATP5B基因组织表达谱结果分析显示,该基因在后腿肌和背最长肌中相对高水平表达,在睾脂、心、瓣胃、皱胃、大肠、小肠、背脂、肾和肝中相对中度表达,在脾、肺、盲肠、瘤胃和网胃中相对微量表达。氨基酸序列比对结果显示,牛ATP5B基因与山羊、绵羊、小鼠、猪和人的ATP5B基因的相似性较高,牛ATP5B基因编码的氨基酸序列与山羊和绵羊的相似性分别高达99%、98%,与人和小鼠的相似性均为96%,与猪的相似性为91%。本研究初步确认了牛ATP5B基因可能的核心启动子,并得到了牛ATP5B基因在16个组织的表达谱结果,软件比对基因序列的结果进一步表明,ATP5B基因是一个较为保守的基因,这为进一步研究牛ATP5B基因的转录调控机制及功能都奠定了基础。     

山羊Kiss-1和GPR54基因的克隆及组织表达研究

为探究Kiss-1和GPR54基因在山羊季节性繁殖中的作用,分别在四川省金堂县和理县各选取5只10月龄处于发情前期的藏山羊和金堂黑山羊为研究对象,对Kiss-1和GPR54基因编码区进行序列及组织表达分析。结果显示:金堂黑山羊和藏山羊Kiss-1基因编码区均长408 bp,编码135个氨基酸,两品种间存在2处同义突变。GPR54基因编码区均长244 bp,编码81个氨基酸,两品种间存在1处同义突变;金堂黑山羊Kiss-1和GPR54基因CDs区核苷酸序列与藏山羊的同源性分别为99.5%、99.6%;Kiss-1和GPR54基因在两品种山羊的卵巢、子宫、输卵管、垂体中均有表达,但只有Kiss-1基因在金堂黑山羊垂体中的表达量显著高于藏山羊(P0.05),而在其他组织品种间差异不显著(P0.05)。提示:Kiss-1基因可能参与调控山羊季节性繁殖,而GPR54基因是否是引起季节性繁殖的原因还有待进一步研究。     

郏县红牛FGF13基因拷贝数变异及其与生长性状关联性分析

本研究旨在检测郏县红牛成纤维生长因子13（fibroblast growth factor 13, FGF13）基因的拷贝数变异（copy number variation, CNV）及其与生长性状之间的相关性分析。本研究利用实时定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术,以57头郏县红牛为研究对象,检测FGF13基因CNV,并利用皮尔逊相关分析进行FGF13基因拷贝数与郏县红牛生长性状的关联分析。结果表明,郏县红牛FGF13基因的相对拷贝数高于对照组秦川牛（P<0.05）,在郏县红牛群体中,FGF13基因CNV位点存在拷贝数增加Gain,拷贝数正常Normal和拷贝数减少Loss三种类型;关联分析结果显示,FGF13基因的相对拷贝数与郏县红牛的体斜长呈显著的正相关（P<0.05）。该研究结果表明,FGF13基因的CNV位点与郏县红牛的生长性状显著相关,可作为分子标记应用于郏县红牛的分子标记辅助选择育种工作中。     

牦牛GPR41基因遗传多态性与生长性状关联性研究

本研究旨在探讨G蛋白偶联受体41(GPR41)基因在牦牛中的遗传多态性,对麦洼牦牛(50头)、申扎牦牛(47头)和类乌齐牦牛(28头)GPR41基因外显子区域片段进行扩增,筛查SNPs位点,利用RFLP分子标记技术鉴定其基因型,开展其与生长性状间的关联分析,为牦牛品种改良和选育提供遗传学依据。结果表明:在麦洼牦牛中未发现突变位点,申扎和类乌齐牦牛在外显子2区域发现1个突变位点,第4570位碱基发生G→A突变,属同义突变;经RFLP鉴定出3种基因型,命名为AA、AG和GG;χ~2适应性检验显示,申扎牦牛基因型分布不符合Hardy-Weinberg平衡(P<0.01),类乌齐牦牛处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);申扎牦牛和类乌齐牦牛均表现为中度多态;GPR41基因不同基因型与申扎牦牛体重和体高显著相关,且GG型显著高于AA型(P<0.05),而GPR41基因不同基因型对类乌齐牦牛各体尺性状无显著性影响(P>0.05)。综上,申扎牦牛GPR41基因G4570A基因座可为牦牛选育过程中分子标记选择提供参考。     

沃金黑牛GPR41基因多态性及其与不同阶段生长性状的相关性分析

[目的]研究旨在探讨GPR41基因多态性对沃金黑牛不同阶段生长性状的影响。[方法]试验共选取63头沃金黑牛(去势公牛)为研究对象,采用Sanger测序技术法检测单核苷酸多态性(SNP)位点,利用Haploview软件进行单倍型分析。利用“牛等家养动物群体遗传分析工具V1.0”评价沃金黑牛群体遗传结构,利用SPSS 19.0软件分析GPR41基因多态性与生长性状的相关性。[结果]结果发现,沃金黑牛GPR41基因外显子2存在2个突变位点,分别为S1:Chr18:46058902 bp处的G/T突变和S2:Chr18:46058908 bp处的C/T突变;S1、S2位点多态性与沃金黑牛不同生长阶段部分生长性状存在显著相关(P<0.05);2个SNPs位点共形成3种有效单倍型组合,单倍型组合H2H2(TT/CC)显著影响沃金黑牛体斜长与背膘厚。[结论]结果表明,GPR41基因SNP位点存在遗传多态性,可用于沃金黑牛(去势公牛)主要生长性状的基因标记参考、稳定与优化。     

GPR54基因多态性与小梅山猪产仔数的关联分析

本研究旨在检测猪GPR54基因多态性,分析其与产仔数之间的关系。采用PCR-SSCP、PCR-R FLP和直接测序方法,对小梅山猪、枫泾猪和大白猪3个群体218头繁殖母猪进行GPR54基因的多态分析,并采用最小二乘法分析其与616窝小梅山母猪繁殖记录的关系。结果表明:在3对引物(P1、P4、P8)中检测到3个多态位点,其中1个多态位点(P1)导致氨基酸的改变(Leu35Pro),P4与P8位点的基因遗传为连锁遗传;P1位点上,2胎以上小梅山母猪中,BB型个体的产活仔数(NBA)比AB型和AA型分别高0.69、1.65头(P0.01),所有胎次中,BB型个体的TNB和NBA均高于AA型(P0.01)和AB型(P0.01);P4/P8位点上,杂合型的总产仔数(TNB)和NBA均高于纯合型。结果提示,对于小梅山猪,P1位点的BB基因型可作为小梅山猪辅助选择的遗传标记。     

Kiss-1/GPR54系统在不同发育阶段五指山猪下丘脑中的表达

采用荧光定量技术研究Kiss-1mRNA和GPR54mRNA在30、60、90(初情期)和120日龄五指山母猪下丘脑表达情况,并检测血清中FSH、LH、E2、P4浓度变化。结果表明:初情期前,Kiss-1mRNA表达量随着五指山猪年龄的增长逐渐升高,到初情期(90日龄)时表达量达到最高(P0.05),120日龄(初情期后)时表达量逐渐降低(P0.05)。GPR54mRNA表达不受影响。血清FSH、LH、E2、P4浓度变化的趋势大体一致,初情期前各激素水平逐渐升高,但差异不显著(P0.05);至初情期(90日龄)时显著升高,且达到一个峰值;血清FSH、LH和E2浓度在90日龄和120日龄时差异不显著(P0.05),P4浓度在90日龄时显著高于120日龄(P0.05)。结果显示:Kiss-1基因是五指山猪初情期启动的关键因子。     

猪GPR54基因在下丘脑、垂体、卵巢发育性表达变化的研究

分别随机选取处于初生、60日龄、120日龄、初情期、180日龄的苏姜猪母猪各4头,进行屠宰,采集下丘脑、垂体、卵巢,采用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）,以-βactin作内标,定量分析下丘脑、垂体、卵巢中GPR54mRNA发育性变化。结果显示：苏姜猪GPR54 mRNA在下丘脑、垂体、卵巢组织内从初生到初情期表达量逐渐上升,初情期后呈下降趋势,初情期GPR54 mRNA表达丰度与初生、180日龄差异显著（P〈0.05）;在不同组织器官中,GPR54 mRNA表达丰度在卵巢中最高,下丘脑中表达丰度最低,下丘脑的表达丰度与垂体、卵巢中的表达丰度均差异显著（P〈0.05）。     

牛GDF5基因启动子的克隆与序列分析

旨在了解生长分化因子5(GDF5)可能的调控序列。本研究通过基因组比对,扩增了牛GDF5基因5′侧翼区,并通过产物纯化、连接、转化及测序比对,确定了2043bp的启动子序列。同时综合考虑已经证实的人GDF5基因启动子结构及应用启动子在线分析软件,对该序列进行分析。结果发现,牛GDF5基因5′侧翼区没有CpG岛,序列比对发现,牛和人GDF5基因启动子区域同源性为78%;牛GDF5基因启动子没有TATAbox或CAATbox结构,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-359bp位置,其潜在的转录因子有AML-la,Ap-1,AmL-la,CdxA,SRY,CdxA,TATA,AmL-la,GTATA-1,MZF1,CdxA,Nkx-2,CdxA,S8和SRY,其中Ap-1,AmL-la,SRY,Nkx-2,S8和SRY高度保守,与人的序列完全一致;推测发现牛GDF5基因启动子-457至-423bp序列中的GT重复序列可以增强启动子的活性,且最小增强子处于-458和-377bp之间。研究结果推测判定了牛GDF5基因启动子的转录起始位置、转录结合位点、活性序列及最小增强子序列,为以后深入研究GDF5基因在牛软骨细胞中的表达机制提供了理论基础。     

梅山与长大母猪下丘脑-垂体-卵巢轴Kiss1和GPR54基因的表达差异

研究早熟与晚熟品种母猪下丘脑-垂体-卵巢轴Kiss1和GPR54基因的表达差异。选用8头梅山母猪与12头长大(LY)母猪为研究对象,梅山母猪于70 d和100 d屠宰,LY母猪于70、100 d和199 d屠宰,收集血清及下丘脑、垂体、卵巢组织样品。ELISA检测血清瘦素(Leptin)和雌二醇(E2)水平,PCR克隆梅山与LY母猪Kiss1基因编码序列,实时荧光定量PCR检测母猪下丘脑、垂体、卵巢组织Kiss1和GPR54基因表达水平。结果表明:梅山与LY母猪Kiss1基因编码序列相似性为100%;梅山与LY母猪初情期下丘脑Kiss1基因表达量极显著高于垂体与卵巢(P<0.01),卵巢GPR54基因表达水平显著高于下丘脑与垂体(P<0.05)。梅山母猪下丘脑-垂体-卵巢轴Kiss1基因表达水平都显著高于相同日龄和初情期LY母猪(P<0.05),梅山母猪血清Leptin水平极显著高于相同日龄LY母猪(P<0.01)。而E2水平显著高于100 d与初情期LY母猪(P<0.01)。Leptin与下丘脑Kiss1和GPR54基因表达呈显著正相关(P<0.05),而E2仅与下丘脑Kiss1基因表达有极显著正相关关系(P<0.01);梅山与LY母猪Kiss1基因编码区序列相似性为100%,梅山母猪下丘脑-垂体-卵巢轴上kiss1基因表达量较LY母猪高,主要原因可能是初情日龄早,下丘脑Kiss1基因表达水平的高低与血清Leptin和E2浓度密切相关。     

山羊GPR1基因的克隆及表达特征分析

本文旨在克隆山羊GPR1基因,对其进行序列分析,并研究组织表达。以简州大耳羊为试验材料,应用RT-PCR方法克隆山羊GPR1基因并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR构建组织表达谱。结果表明:山羊GPR1基因编码区长度为987 bp(Gen Bank登录号:KT347601),编码蛋白为稳定疏水蛋白;存在7个跨膜结构域,在69~304氨基酸序列属于G蛋白偶联受体家族保守结构域(Pfam:7tm-1);荧光定量PCR分析表明,GPR1在24月龄山羊心、肝、脾、肺、肾、脂肪、背最长肌、股二头肌和臂三头肌中均有不同程度的表达,其中肺脏中表达量最高且极显著高于其他组织(P0.01),脂肪、脾、肝和心次之,股二头肌中表达量最低;GPR1基因在1~3月龄与24月龄表达变化趋势相同,由背最长肌、股二头肌和臂三头肌呈现逐渐上升的趋势,而8~10月龄则呈现相反的变化趋势。该实验结果为进一步研究GPR基因提供理论基础。     

发情周期不同阶段KiSS-1和GPR54 mRNA在小尾寒羊卵巢上表达规律的研究

研究发情周期不同阶段KiSS-1和GPR54 mRNA在小尾寒羊卵巢中的表达规律,为从分子水平阐明小尾寒羊多胎性的奠定基础。将12只雌性小尾寒羊随机分为4组,分别处于发情前期、发情期、发情后期和间情期,每组3只,颈动脉放血致死后采集卵巢,采用实时荧光定量PCR技术研究发情周期不同阶段母羊卵巢上KiSS-1和GPR54基因的表达规律。结果表明:母羊发情周期各阶段卵巢上均有KiSS-1和GPR54基因表达;发情期母羊卵巢KiSS-1基因的表达量显著提高(P<0.01),比发情后期、间情期和发情前期分别提高了1.0、1.7倍和1.4倍,发情周期不同阶段GPR54基因在卵巢上的表达量无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,发情期母羊卵巢上KiSS-1基因的表达量极显著高于发情周期其他阶段,提示卵巢上KiSS-1表达可能参与母羊排卵过程的调节。     

不同月龄阶段关岭牛MYH3和MYH4基因mRNA表达水平的研究

为研究MYH3基因和MYH4基因m RNA在关岭牛不同月龄阶段m RNA的表达水平,试验以GAPDH为内参基因,采用实时荧光定量PCR技术对关岭牛胎儿、18月龄、30月龄时期MYH3基因和MYH4基因m RNA的表达规律进行研究。研究结果表明,MYH3基因和MYH4基因m RNA表达水平随着时间的推移呈上升趋势,推测随着年龄增加肌肉丰满度增加,基因表达量也随之增加。本研究揭示了关岭牛MYH3基因和MYH4基因在不同年龄阶段m RNA表达特征。     

猪PDZD8基因表达水平检测及其启动子区生物信息学分析

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是严重影响养猪产业的一种疾病,每年给世界各国带来巨大的经济损失。本研究旨在分析猪PDZD8在PRRS防控中可能发挥的作用。笔者以感染PRRSV不同时间点的Marc-145细胞为材料,检测猪PDZD8在PRRSV感染前后表达水平,利用生物信息学软件进行不同物种PDZD8基因启动子序列相似性分析及系统进化树的构建,分析猪PDZD8核心启动子区、CpG岛结构、转录因子结合位点等。RT-qPCR结果表明,随着PRRSV感染时间的增加,PDZD8的表达水平呈显著下降趋势。通过不同物种比对分析,猪PDZD8启动子区序列与人、印度狐狸、狗和蓝鲸的相似性较高,分别达到74.0%、75.1%、79.8%和81.0%,系统进化树也佐证了这一结果。生物信息学结构预测发现,猪PDZD8启动子区存在2～3个核心启动子区、2个CpG岛及多个转录因子结合位点。值得注意的是,科学家发现其核心启动子区和CpG岛存在重叠的现象,也发现了一些与PRRSV相关的重要转录因子结合位点。本研究为深入研究猪PDZD8在PRRSV感染过程中的作用提供了理论基础。     

光照强度对Kisspeptin及其受体GPR54在鸡脑表达的影响

随机选用100日龄京红Ⅰ号蛋鸡,分别接受光照强度30,20,10,1 lx处理,运用免疫组化技术测定Kisspeptin和GPR54免疫反应阳性神经元在鸡中脑和间脑的分布和表达。结果显示:Kisspeptin免疫反应阳性神经元主要分布于中脑SGC、Imc、Ipc、顶盖前核(Pt)、外侧螺旋核(SPL)。在SGC、Imc、Ipc,平均灰度值和面积百分比,30,20 lx组显著高于10,1 lx组(P<0.05),在Pt和SPL,30 lx平均灰度值和面积百分比最高。GPR54免疫反应阳性神经元主要分布于中脑的lmc、Ipc、SP/IPS、nbor、SGC,平均灰度值和面积百分比,光照强度30,20 lx组显著大于l0,1 lx组(P<0.05)。Kisspeptin免疫反应阳性神经元主要分布于间脑的下丘脑后内侧核(MPH)、丘脑室旁核前部(PVa)、PHN、PVN、Rot。在Rot、PHN、PVN和PVa,Kisspeptin免疫反应阳性神经元平均灰度值和面积百分比,30,20 lx组显著大于l0,1 lx组(P>0.05);在MPH,30 lx高于20 lx,20 lx高于10 lx,10 lx高于1 lx组。GPR54免疫阳性神经元主要分布于鸡间脑PVN、GLv、Rot、PHN和CPa。平均灰度值和面积百分比在Rot,30 lx组最大,但各组间差异不显著(P>0.05),在PVN、PHN、GLv和CPa,30,20 lx组显著大于10,1 lx组(P<0.05)。Kisspeptin免疫反应阳性细胞在腺垂体的平均灰度值,光照强度20 lx组最大,面积百分比30 lx最大,但差异不显著(P>0.05)。结果表明,光照强度能促进Kisspeptin和GRP54在蛋鸡中脑和间脑表达,随光照强度增加,表达量增加。Kisspeptin接受光信息调控,通过调节GnRH分泌,参与调节鸡的生殖机能。     

不同启动子对重组痘苗病毒表达狂犬病病毒糖蛋白基因的影响

以血凝素（ＨＡ）基因为侧翼，将狂犬病病毒糖蛋白基因ｃＤＮＡ置于不同类型的痘苗病毒复合启动子下游，构建了４种表达质粒。重组表达质粒转染已感染ＷＲ株痘苗病毒的ＢＨＫ２１细胞，并通过鸡红细胞吸附试验，筛选、纯化出与表达质粒对应的４组ＨＡ－重组痘苗病毒：ｖＳＦＪ１－１０ＲＶｇｐ，ｖＳＦＪ２－１６ＲＶｇｐ，ｖＲＪ１－１０ＲＶｇｐ，ｖＲＪ２－１０ＲＶｇｐ。经间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）鉴定，从４组重组病毒中每组各鉴定出１株阳性重组病毒。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示，重组病毒感染的ＢＨＫ２１细胞裂解物上清中有１种蛋白与抗ＲＶＧＰ的ＭｃＡｂ发生特异反应，分子量为６９０００。在重组病毒感染早期，ＲＶＧＰ的表达量以ｖＳＦＪ１－１０ＲＶｇｐ最高；而在感染晚期，则以ｖＳＦＪ２－１６ＲＶｇｐ最高。４株重组病毒免疫小鼠，均能够不同程度地诱导小鼠产生抗ＲＶＧＰ特异性抗体。     

广西牛支原体主要抗原基因的变异分析

为了解牛支原体广西分离株的P81基因和vspY1基因的变异特点,为牛支原体病的诊断和防控提供依据,本研究对7株牛支原体广西分离株P81和vspY1基因进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析。序列分析结果显示,7株牛支原体的P81基因全长为2 100bp,编码700个氨基酸残基;vspY1全长为948bp^1 029bp,编码316~343个氨基酸残基。核苷酸相似性结果显示,7株分离株与参考株之间的P81基因相似性为94.7%~99.9%,而vspY1基因的相似性为78.4%~100%。核苷酸进化树结果表明,7株牛支原体P81基因和vspY1基因均与标准株PG45分属于不同的分支。抗原表位预测结果显示,7株分离株P81含有26~28个潜在的抗原表位,vspY1基因含有6~7个潜在的抗原表位。试验结果表明P81较保守,变异小,而vspY1基因变异较大,且P81和vspY1蛋白均存在抗原表位。