牛PPARγ基因对脂肪细胞增殖分化的影响

取郏县红牛第6和第7肋骨间肌间脂肪组织为试验材料,分离并培养原代前体脂肪细胞。在诱导分化牛前体脂肪细胞过程中,添加终浓度为1μmol/L的吡格列酮对脂肪细胞进行药物干预,上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferations actirated receptorγ,PPARγ)基因的表达后,通过MTT检测牛前体脂肪的增殖;油红O提取比色法检测牛前体脂肪细胞分化过程中脂滴的分泌;利用real-time PCR技术检测PPARγ基因表达上调后其他参与脂肪分化相关基因的表达情况。结果显示:吡格列酮药物干预后,PPARγ基因表达明显上调(P0.01);PPARγ基因的表达上调后,牛脂肪细胞的增殖能力下降,分化能力增强;脂肪分化相关基因C/EBPA、SREBP11、FABPA、PLIN1、LPL和IGFBP2的表达量明显上调(P0.05),GATA2和FAS基因的表达量没有发生明显变化。结果表明:PPARγ基因的表达可显著影响脂肪细胞的增殖与分化,可能与肉牛脂肪沉积有一定的关系。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

山羊myostatin基因慢病毒RNA干扰载体的构建及效果验证

myostatin基因是肌肉生长和发育的关键负调控因子之一,该基因突变或失活的物种都呈现肌肉增大的双肌表型,暗示在家畜中使该基因失活可以增加其产肉量。为了进一步揭示myostatin在山羊胎儿成纤维细胞中的生物学功能以及制备可有效失活myostatin基因的工具,将筛选的myostatin基因潜在RNA干扰靶位点连接到慢病毒干扰载体的转移质粒中,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,验证其干扰效果。结果表明,干扰序列与转移质粒连接正确,成功构建myostatin基因慢病毒干扰载体,慢病毒三质粒共转293T细胞,获得的慢病毒颗粒可高效转染山羊胎儿成纤维细胞,Real-time PCR检测发现慢病毒干扰载体Lv322有效减少山羊胎儿成纤维细胞中myostatin基因mRNA 75%的表达(P<0.01),Western blotting检测显示myostatin蛋白则有效降低了94%(P<0.01)。本试验为研究myostatin基因的功能及制备失活转基因动物提供有效工具以及理论基础。     

家兔PPARγ基因的克隆表达及肌内脂肪含量的相关性分析

为了克隆家兔过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferative activated receptor gamma, PPARγ)基因蛋白质编码区(CDS)序列,并研究其生物学功能、组织表达规律及与肌内脂肪(IMF)含量的关系,试验克隆了家兔PPARγ基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析;采集70日龄新西兰白兔心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、子宫、胃、腿肌、腹肌、背最长肌,0,35日龄新西兰白兔背最长肌,70日龄豫丰黄兔腿肌、腹肌、背最长肌,通过qRT-PCR扩增检测了PPARγ基因在不同组织/器官中的相对表达量;测定了70日龄新西兰白兔和豫丰黄兔腿肌及背最长肌的IMF含量,并对PPARγ基因相对表达量与IMF含量进行相关性分析。结果表明：家兔PPARγ基因CDS序列长1 428 bp,共编码475个氨基酸,其核苷酸序列与GenBank上公布的人、鼠、猪、绵羊、牛、马、犬及鸡等物种的氨基酸序列相似性分别为91.0%、90.5%、90.5%、90.2%、90.1%、90.0%、89.9%和80.5%,与小鼠的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。PPARγ基因在70...     

长链非编码RNA AK005183干扰载体构建及慢病毒包装

为研究长链非编码RNA AK005183在精子发生中的功能,设计、合成了干扰AK005183表达的shRNA序列,并构建其干扰表达重组慢病毒载体CD513B-U6-AK005183,将干扰表达质粒及对照质粒分别转染NIH3T3细胞系,实时定量PCR检测CD513B-U6-AK005183质粒对AK005183的表达具有较好的干扰效果。利用第三代慢病毒包装系统,将CD513B-U6-AK005183、pGag-Pol、pRsv-rev、pVSV-G质粒共转染293T细胞系,包装得到滴度为5×106 TU/mL的干扰表达重组慢病毒。用CD513B-U6-AK005183慢病毒转导GC-1spg细胞系,检测到AK005183的表达下调64%。表明本研究成功构建并包装得到高效干扰长链非编码RNA AK005183表达的重组慢病毒,将为深入研究长链非编码RNA在精子发生过程中的功能奠定了基础。     

猪skMLCK基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率测定

为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。     

山羊ATF6基因重组慢病毒干扰载体的构建及鉴定

为了研究ATF6通路介导的山羊胎盘滋养层细胞(goat trophoblast cell,GTC)凋亡的作用机制,需要构建激活转录因子6(ATF6)基因慢病毒干扰载体用于试验。采用RNA干扰技术,设计合成以山羊ATF6基因CDS区为靶点的shRNA,构建重组慢病毒载体、慢病毒包装、慢病毒转染、RT-qPCR和Western blot等方法,筛选出干扰效率达60%的shRNA干扰片段,构建出可用于今后ATF6通路相关研究的重组慢病病毒干扰载体,为山羊妊娠相关研究提供材料。     

绵羊NYD-SP27基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。     

秦川肉牛PAI1基因生物信息学分析及其对肌内脂肪细胞增殖和分化的影响

【目的】对秦川肉牛纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI1)基因进行生物信息学分析,检测PAI1基因在秦川肉牛不同组织中的表达水平并研究其功能,为秦川肉牛肌内脂肪沉积的分子育种提供理论依据。【方法】以分离自秦川肉牛背最长肌的肌内脂肪细胞为试验材料,PCR扩增PAI1基因CDS区,对所获序列进行相似性分析及系统进化树构建,并通过生物信息学软件预测其编码蛋白的结构和功能。通过实时荧光定量PCR检测PAI1基因在秦川肉牛不同组织中的表达量。合成PAI1基因siRNA并转染秦川肉牛肌内脂肪细胞,试验分为两组：对照组(NC)和干扰组(si-PAI1),通过EdU染色、CCK-8检测、流式细胞术、油红O染色观察表型变化,采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测转录和翻译水平标志基因(PCNA、CDK1、CCND2、PPARG、PLIN2、FABP4)的表达。【结果】试验成功扩增出PAI1基因CDS区,大小为1 054 bp。牛PAI1基因氨基酸序列与水牛、山羊、人、小鼠、绵羊、黑猩猩的相似性分别为96.8%、95.8%...     

猪Sirt2慢病毒干扰载体的构建

为了研究猪Sirt2基因在脂肪细胞增殖和分化中的作用,试验针对Sirt2基因设计并合成了3对siRNA序列,经退火、酶切后连接于慢病毒表达载体LentiH1上,然后与慢病毒包装质粒混合共转染293T细胞,48 h后收集细胞,浓缩病毒,并检测病毒效价和感染效率.结果表明:3个shRNA慢病毒干扰载体经包装浓缩后获得的病毒...     

小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。     

陕北白绒山羊KAP9.2基因腺病毒载体的构建及包装

研究旨在构建能够表达KAP基因家族角蛋白相关蛋白9.2(KAP9.2)基因的腺病毒载体,为研究KAP9.2在绒山羊绒毛生长中的功能奠定基础。通过外科手术采集陕北白绒山羊皮肤组织,采用酚/氯仿法提取其基因组,设计引物,通过PCR技术扩增KAP9.2基因。通过酶切连接构建pAdTrack-KAP9.2穿梭载体。将该穿梭载体经Pme I线性化后与pAdEasy-1载体共转化到BJ5183细菌中进行重组,经过卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-KAP9.2。将pAdEasy-KAP9.2经Pac I酶切线性化后转染HEK293人胚肾细胞,培养7d后收集细胞,反复冻融破碎细胞,离心收集病毒。在病毒扩增4次后,采用LaSRT法测定其滴度。最终测得病毒滴度为1.34×108 GFU/mL。研究成功包装KAP9.2基因重组腺病毒颗粒。     

猪MyD88基因干扰重组慢病毒载体的构建、病毒包装及效果评价

髓性分化因子88(MyD88)作为TLRs/IL-1R信号通路中重要的接头蛋白,在免疫应答和疾病防御中起重要作用,作者拟通过慢病毒介导的RNA干扰技术获得MyD88基因沉默的猪小肠上皮细胞,为致病菌引起肠道疾病机制研究提供有效模型。共构建4个靶向猪MyD88基因的shRNA表达载体和1个MyD88基因高表达载体,通过实时荧光定量PCR方法鉴定瞬时共转染293细胞中MyD88基因转录水平,筛选获得干扰猪MyD88基因效率最高的shRNA表达载体,将其包装成慢病毒载体,用于建立MyD88基因稳定沉默的猪小肠上皮细胞。最终成功获得MyD88基因沉默效率达到69.3%的小肠上皮细胞,达到基因功能分析的要求。MyD88基因稳定沉默猪肠上皮细胞的获得,为猪肠道病原微生物所引起的TLRs/IL-1R信号通路作用机制的研究提供了宝贵材料。     

山羊FST慢病毒载体构建及其对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

研究卵泡抑素(FST)对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响。采集山羊卵巢组织、分离培养原代卵巢卵泡颗粒细胞,RT-PCR克隆山羊FST,设计shRNA片段,构建慢病毒过表达载体和干扰载体,感染原代卵巢卵泡颗粒细胞,qPCR技术检测过表达与干扰的效果, CCK-8检测细胞的增殖效果。结果显示:分离培养的山羊卵巢卵泡颗粒细胞经促卵泡素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,阳性率为95%;慢病毒感染颗粒细胞时荧光蛋白的表达占比80%;qPCR验证FST过表达和干扰慢病毒载体的效果均显著(P0.05);过表达FST显著(P0.05)抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,干扰FST显著(P0.05)促进卵巢卵泡颗粒细胞增殖。笔者分离出山羊卵巢卵泡颗粒细胞,成功构建FST过表达和干扰两种慢病毒载体,感染结果表明FST能够抑制山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,为进一步研究FST在哺乳动物卵泡发育调控中的作用及其机制提供了基础资料。     

干扰MSTN对绵羊成肌细胞增殖分化及相关基因表达的影响

旨在探讨MSTN基因对绵羊成肌细胞增殖和分化的作用及相关机制,进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的生物学功能。本研究利用重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞内源性MSTN基因表达,通过CCK-8法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,qRT-PCR检测p21基因表达。成肌细胞诱导分化后利用免疫细胞化学技术检测肌管的形成情况,统计细胞融合率,qRT-PCR检测诱导48、72、96h后MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表达量变化。结果发现,干扰MSTN后成肌细胞的增殖受到抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,并且p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中,发现干扰组与阴性对照组相比,诱导48h4个生肌调节因子的表达量均呈下降趋势,MyoG基因表达显著下调(P0.05);诱导72h干扰组成肌细胞融合率极显著高于阴性对照组(P0.01),Myf5和Myf6基因表达量极显著降低(P0.01),MyoD基因表达量升高不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著增加(P0.01),诱导96h,Myf5基因表达量显著降低(P0.05),MyoD基因表达量降低不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著降低(P0.01),Myf6基因表达量升高不显著(P0.05)。另外诱导72h,HACD1基因的表达量在干扰组中显著高于阴性对照组(P0.05),诱导48和96h无显著变化。研究表明,干扰MSTN表达对成肌细胞的增殖有抑制作用,对分化有促进作用,HACD1基因与成肌细胞融合相关。     

家兔DEPTOR基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与验证

为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：...     

柑橘黄化脉明病毒RNA干扰载体的构建及遗传转化

本研究利用RNAi介导的病毒抗性的原理,以柑橘上发生频繁、危害严重的柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)为研究对象,以期得到对CYVCV具有抗性的转基因植株。根据CYVCV的CP基因和RP基因序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,获得RNA干扰片段,分别构建RNA干扰载体ihpCP-pGN、ihpRP-pGN和ihpCPRP-pGN,将干扰载体转入农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行柑橘的遗传转化,获得两株转基因阳性植株,为培育抗CYVCV病毒柑橘品种提供技术参考和理论基础。     

调控牛CEBPA基因表达的miRNA筛选及对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

旨在筛选并验证调控牛增强子结合蛋白A(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)表达的miRNA及其对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响.本研究综合运用多个在线软件筛选与CEBPA基因具有潜在调控关系的miRNA,运用qRT-PCR技术检测CEBPA基因在关岭牛各类组织中的表达...     

调控牛CEBPA基因表达的miRNA筛选及对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

旨在筛选并验证调控牛增强子结合蛋白A(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)表达的miRNA及其对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响。本研究综合运用多个在线软件筛选与CEBPA基因具有潜在调控关系的miRNA,运用qRT-PCR技术检测CEBPA基因在关岭牛各类组织中的表达水平;构建CEBPA-3′UTR-WT和CEBPA-3′UTR-MUT双荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶报告系统验证候选miRNA与CEBPA基因的结合关系;分离培养关岭牛肌内前体脂肪细胞,利用qRT-PCR、Western blot、油红O染色和CCK-8探究调控CEBPA的miRNA对牛肌内前体脂肪细胞分化与增殖的影响。生物信息学分析发现,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a、bta-miR-181b、bta-miR-181c、bta-miR-181d与CEBPA基因具有潜在结合关系;qRT-PCR结果表明,CEBPA基因在关岭牛内脏组织、肌肉组织、脂肪、下丘脑以及部分生殖器官中均有表达,在2岁牛背最长肌的表达量极显著高于1日龄犊牛(P0.01);双荧光素酶报告系统结果表明,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能直接结合牛CEBPA基因3′UTR;细胞试验结果表明,CEBPA基因在牛肌内前体脂肪细胞分化中的表达水平随时间逐渐升高,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a在分化0 d表达水平极显著高于其他时期(P0.01),整个分化时期bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a与CEBPA基因表达趋势相反;过表达miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能极显著降低CEBPA基因mRNA和蛋白表达量(P0.01),并降低牛肌内前体脂肪细胞中脂滴含量;bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能阶段性促进细胞增殖。结果表明,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能阶段性的促进牛肌内前体脂肪细胞增殖,并通过直接负调控CEBPA的表达来间接影响该细胞分化。