气单胞菌属低温淀粉酶基因改造与原核表达

【目的】获取低温淀粉酶基因,分析其相关功能,为工业生产上的应用提供参考。【方法】以气单胞菌(Aeromonas)LA77为出发菌株克隆低温α-淀粉酶基因,以BL-21(DE3)为宿主菌进行克隆。分析其它已知气单胞菌属低温α-淀粉酶基因同源性,设计特异引物,PCR扩增获得C13片段,将其克隆到pMAL-2X,转化到BL-21(DE3)中,筛选蓝白斑,验证PCR及EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切,获得高效表达生物工程菌株pMAL-2X-C13。设计定点突变引物,以pMAL-2X-C13为模板,获得低温淀粉酶基因突变株三株C19、C29、C43。【结果】表达蛋白的分子大小为114kD,突变菌株C19蛋白表达量均高于pMAL-2X-C13。【结论】低温淀粉酶基因突变株C19比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表达量更高。     

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株鞭毛flaA基因的克隆与生物信息学分析

以框镜鲤Cyprinus carpio维氏气单胞菌Aeromonas veronii CY0806株细菌基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得flaA基因,将其克隆并测序,测序结果与气单胞菌属的不同菌株进行相似性分析,并对flaA基因编码蛋白质进行生物信息学分析.结果显示:获得框镜鲤维氏气单胞菌鞭毛flaA基因,长915 bp,编码304个氨基酸,系统进化树分析,其与其他维氏气单胞菌flaA基因处于同一分支,相关生物信息学分析显示,flaA基因编码的蛋白质相对分子质量32 098.66,等电点5.57,半衰期30 h,不稳定系数为32.31,脂肪系数81.05,不存在信号肽和跨膜区,二级结构预测:flaA基因以α螺旋和β折叠为主,同时,以同源建模法预测了flaA基因编码蛋白的三维立体结构.     

大麻THCA合成酶基因的克隆及生物信息学分析

[目的]为了得到不能产生任何有活性的THC基因型大麻株系,本试验对四氢大麻酸(THCA)合成酶基因进行克隆和生物信息学分析,这为深入研究CsTHCA的功能提供理论基础。[方法]以大麻品种火麻一号为材料,采用RT-PCR技术克隆THCA合成酶基因(CsTHCA)并对其进行生物信息学分析。[结果]该基因开放阅读框全长1 638bp,编码545个氨基酸。推导的氨基酸序列在309~760bp处与野生种花生和蔓花生序列一致性达74%。理化特性分析发现此蛋白为疏水蛋白且结构稳定。蛋白结构功能域分析预测该蛋白质序列中有跨膜区域,大部分组成为疏水性氨基酸。[结论]本文从大麻中克隆了THCA基因并对其进行了生物信息学分析,可为后续分子机制的研究提供理论依据。     

黄单胞菌α-淀粉酶基因的克隆、测序及表达探讨

用鸟枪法构建了野油菜黄单胞茵(Xanthomonas campestris pv．campestris)8004的基因组文库,经LBSP法筛选,得到了含α-淀粉酶基因的基因片段,SDS-PAGE凝胶电泳确定其蛋白质分子量约为45kd;经测序后,分析其序列结构并翻译成氨基酸序列．     

蟹源易损气单胞菌气溶素基因的克隆及其PCR检测

利用设计的特异引物,采用PCR技术,对蟹源致病性易损气单胞菌气溶素基因(aer)进了克隆和序列分析,从其基因组中克隆出长为622 bp的基因片断,用限制性内切酶BamHI对扩增产物进行酶切,产生长约570 bp和50 bp两条片断;研究还利用设计的特异引物,对蟹源致病性易损气单胞菌进行PCR快速分子鉴定的研究.     

薄荷MhLS基因的克隆及生物信息学分析

柠檬烯合酶(limonene synthase,LS)催化合成薄荷挥发油主要单萜类化合物的共同合成前体。为了更深入地了解柠檬烯合酶,首次从国产薄荷品种738中克隆到柠檬烯合酶基因MhLS的cDNA全长序列,开放阅读框(ORF)长度为1 797 bp,编码599个氨基酸。蛋白质分子质量约为70 ku、理论等电点pI为5.3,亮氨酸(Leu)所占比例最高,而半胱氨酸(Cys)所占比例最低。MhLS基因推导的氨基酸含有植物萜类合酶(Terpene_cyclase_plant_C1)保守区域,具有典型的类异戊二烯合成酶(Isoprenoid_Biosyn_C1)超家族结构域。本研究所获得的MhLS与薄荷属其他种所获得的MhLS基因编码的氨基酸序列高度相似。     

鞘氨醇单胞菌TP-3中基因spsK的克隆及生物信息学分析

以自杀性质粒pUT携带的mini—Tn5转座子对菌株TP-3进行转座诱变,从转座突变库中筛选到不能合成产物鞘氨醇胶ss的突变株,进而采用Tn5外向扩增与LP—RAPD／fN结合的方法,得到糖基转移酶编码基因spsK的801bp序列全长。生物信息学分析表明,其氨基酸序列与迪特胶以及S88合成途径中的糖基转移酶同源性最高,达47％;SpsK蛋白具有典型的G—loop和DXD保守模式,属于糖基转移酶的GT—A家族。     

维氏气单胞菌AcrV基因的克隆与原核表达

【目的】克隆维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）低钙反应蛋白（AcrV）并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,进行EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对 pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度（0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L）和诱导时间（2,3,4和5 h）进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。     

光核桃AmSO基因初克隆及生物信息学分析

为了初步探索光核桃（Amygdalus mira）亚硫酸盐氧化酶（Sulfite oxidase,SO）的蛋白结构与功能,以1 a生光核桃叶片cDNA为模板,采用分子克隆技术获得光核桃AmSO基因全长为1 182 bp的开放阅读框（ORF）,共编码393个氨基酸,相对分子质量是43.45 ku。生物信息学分析结果显示,AmSO蛋白是一种能在细胞核内发挥生物学作用的稳定碱性亲水蛋白,二级结构由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链构成。蛋白结构域的预测及氨基酸序列同源性比对发现,编码氨基酸序列的N端具有氧化钼结构域,常存在于氧化还原酶中,可以与钼辅因子结合;在C端具有钼钴（Mo-co）二聚体结构域,该结构域参与二聚体的结合,并且能够参与硫、氮和碳循环中的氧化还原反应,二者在进化过程中高度保守。系统进化树分析表明AmSO与碧桃PpSO亲缘性最近,进化相对保守。对光核桃AmSO蛋白进行生物信息学预测,有助于进一步系统研究光核桃 AmSO基因在生物学上的功能,为进一步了解其对非生物胁迫的响应机制奠定基础。     

桃树PpGL2转录因子基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆桃树同源异型—亮氨酸拉链(HD-ZIP)基因(PpGL2),并对其进行生物信息学分析,为研究HD-ZIP转录因子在植物生长发育过程中的调控机制提供理论依据.[方法]采用RT-PCR从桃树品种春喜中克隆Pp-GL2基因的开放阅读框(ORF)全长,对其进行序列分析,并构建其亚细胞定位表达载体,通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的分布情况;同时利用酵母单杂交方法检测其转录活性和DNA结合位点及活性.[结果]从桃树幼叶中克隆获得PpGL2基因,其ORF全长为2253 bp,编码750个氨基酸,以碱性氨基酸较多,含典型的START结构域,属于HD-ZIP转录因子家族的Ⅳ亚族,是一种核定位蛋白.PpGL2转录因子与核桃、可可、苹果等HD-ZIP转录因子的氨基酸序列同源性均在84.60%以上,其中与苹果HD-ZIP转录因子(XP_008384034.1)的同源性最高,为92.41%,表明不同物种的HD-ZIP转录因子氨基酸序列高度保守.PpGL2在酵母细胞中具有转录活性和DNA结合活性,可特异性结合回文序列CAATAATTG.[结论]PpGL2转录因子属于HD-ZIP转录因子家族的IV亚族,定位于细胞核,与DNA的结合位点是回文结构CAAT(A/T)ATTG,可能参与调节桃树的生长、发育及抗逆性等重要生理过程.     

猪LBP基因电子克隆及生物信息学分析

利用电子克隆技术,以人脂多糖结合蛋白（LBP）基因（NM₀04139）为种子序列,克隆猪LBP基因。结果表明:所克隆的LBP基因开放阅读框长为1 446bp,编码481个氨基酸。推导其氨基酸序列与人、小鼠、大鼠、牛、狗的相似性分别为74.2%、64.8%、63.2%、77.1%和74.6%。进化树分析显示,猪与牛LBP基因进化距离最近,与大鼠最远。生物信息学分析表明,所克隆的猪LBP蛋白分子大小为53.036 7ku,理论等电点为6.43;亚细胞定位预测猪LBP属于分泌蛋白,主要在线粒体（44.4%）和高尔基体（22.2%）中表达;N端存在信号肽,且在25～26位氨基酸可能存在裂解位点。N端的疏水性较强,且位于信号肽处,最大疏水性值为2.478,最大亲水性值为1.956;由胞外区（1～6位氨基酸）、跨膜区（7～29位氨基酸）和胞内区（30～481位氨基酸）3个部分组成的膜蛋白,有9个Ser、8个Thr和2个Tyr,可能成为蛋白激酶磷酸化的位点;LBP膜外区蛋白由多个α螺旋,膜内区由多个β折叠构成,α螺旋和β折叠平行交替排列,构成一个弯曲螺旋状结构;在33～256和271～474位氨基酸残基之间分别有1个BPI1和BPI2的保守结构域。     

香蕉枯萎病菌SNF1基因的克隆及生物信息学分析

为了解SNF1基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的作用以及FOC1和FOC4两个生理小种之间的致病力差异关系,采用了PCR、RT-PCR的方法扩增了2个生理小种的SNF1基因,测序并采用生物信息学软件对相似序列进行搜索、比对,并对该基因编码的预测蛋白进行氨基酸序列比对和分析。研究结果显示,2个生理小种的SNF1基因的ORF分别为2 136、2 130 bp,二者相差6个碱基,同源性为99.5%。FOC1和FOC4的SNF1基因分别编码711、709个氨基酸,相差两个氨基酸,为丝氨酸(FOC1)和谷氨酰胺(FOC1)。生物信息学软件预测结果表明该蛋白N端不存在信号肽,但具有两个相同的功能结构域位点,分子量约为79 ku,pI为6.80。     

马铃薯促分裂原活化蛋白激酶激酶基因的电子克隆与生物信息学分析

摘利用电子克隆获得马铃薯促分裂原活化蛋白激酶激酶基因(MAPKK)的cDNA序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白质的一般理化性质、疏水性、三维结构、亚细胞定位和系统进化关系等方面进行预测和分析。结果表明:马铃薯促分裂原活化蛋白激酶激酶基因的cDNA序列全长1 669 bp,包含1个1 074 bp的ORF,编码357个氨基酸。马铃薯MAPKK为一亲水性的细胞质蛋白,α-螺旋、β-股和无规则卷曲是其主要的二级结构,该酶与同为茄科植物番茄、烟草的MAPKK的亲缘关系最近。     

香蕉MYB转录因子基因的电子克隆及生物信息学分析

采用电子克隆方法获得香蕉MYB基因.通过生物信息学方法,对此序列编码的蛋白质从氨基酸组成、理化性质、疏水性/亲水性、结构域及其空间结构等方面进行了预测和分析.结果表明:香蕉MYB基因编码序列全长1 266 bp,包含1 266 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,含有1个保守的MYB功能域、1个SANT保守结构域.在序列组成、理化性质、结构域及空间构象等方面,与小麦等其他植物的MYB转录因子具有高度的相似性.     

扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因的克隆与生物信息学分析

钙调蛋白(calmodulin,CaM)对生物体内多种Ca2+依赖的细胞功能和酶体系都有重要的调节作用。为研究扶桑绵粉蚧的信号转导受体蛋白,首次克隆了扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因PsCaM的cDNA全长序列,其开放阅读框(ORF)包含447bp的片段,编码148个氨基酸。PsCaM基因由3个内含子和4个外显子组成。3个内含子的长度分别为73、81、72bp,分隔的4个外显子的长度分别为33、133、183、98bp。功能域分析结果显示:该蛋白具有2个EF-hand结构域,有13个Ca2+结合位点;该蛋白的理论等电点是6.21,属于稳定蛋白,且没有跨膜区域;通过同源建模获得了其蛋白的三维结构。多序列比较显示,PsCaM基因相对较保守。     

气单胞菌几丁质酶的产酶条件优化研究

[目的]为了进行气单胞菌几丁质酶产酶条件的研究。[方法]从自然死亡家蚕中肠围食膜中分离的气单胞菌进行产酶优化试验。其优化条件为:粉状几丁质1.2%,K2HPO4 0.12%,乙酸铵0.02%,发酵72 h,温度为30℃,起始pH值为8.0,培养基装量为15%。[结果]结果表明:该菌株所产几丁质酶的最适反应温度为25℃,pH值5.5,耐温性较差,但pH值5.0～9.0的酶活力较稳定(>88%)。[结论]该研究提供了提高几丁质酶产量的途径,但对该菌株进行基因改造或诱变育种,充分发掘其产酶潜力,对其几丁质酶基因进行克隆、表达等仍需进一步研究。     

SgP5CS基因克隆和生物信息学分析

利用同源克隆的方法,获得了碱蓬P5CS基因全长ORF,命名为SgP5CS。SgP5CS ORF全长2 151 bp,生物信息学软件预测其编码716个氨基酸组成的多肽,相对分子量为77 431.8 u, 等电点为5.71,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域。ClustalX多重序列比对发现SgP5CS编码的氨基酸序列与盐角草P5CS相似性为93%,与盐角草P5CS的亲缘关系最近,其次是甜菜。脯氨酸是生物体内重要的渗透调节剂,而Δ1 吡咯啉 5 羧酸合成酶则是植物合成脯氨酸的关键酶之一,SgP5CS的克隆将为进一步的功能分析鉴定基础。     

普通小球藻八氢番茄红素合成酶基因psy的cDNA克隆及生物信息学分析

通过RACE-PCR首次克隆获得了普通小球藻(Chlorella vulgaris)中八氢番茄红素合成酶编码基因psy 的cDNA全长序列.该序列全长1 605 bp,包括1 245 bp开放阅读框,编码415个氨基酸.氨基酸序列对比及系统发生分析表明其与其他物种的PSY蛋白具有同源性,与绿藻聚为一支,与小球藻(Chlorella variabilis)、原壳小球藻(Auxenochlorella protothecoides)和佐夫色绿藻(Chromnochloris zofingiensis的遗传距离最近(分别为0.173、0.188和0.239),并具有较高的相似性(81％ ～ 84％)和一致性(69％ ～ 76％).亚细胞定位预测表明普通小球藻PSY前45个氨基酸残基为叶绿体转运肽,可能引导翻译后的肽链进入叶绿体.保守区块、特征基序分析及三维建模显示,序列中具有多个潜在的蛋白质修饰位点,以及PSY蛋白的保守区块和特征基序,包括两个保守的底物-镁离子结合位点和两个活性位点遮蔽残基,用于结合底物及保护催化反应中间产物;普通小球藻PSY蛋白中还具有一个特异的底物-镁离子结合位点,其活性和功能还未知.总之,研究结果揭示了普通小球藻psy基因的cDNA全长序列及可能的蛋白质序列结构特性,结果可为构建过表达载体,提高类胡萝卜素产量提供相关信息.     

甘肃黑猪H-FABP基因克隆、SNPs筛查及生物信息学分析

采用生物信息学方法从分子水平对甘肃黑猪H-FABP基因编码蛋白质的功能和性质进行分析。采用DNA池和直接测序技术对甘肃黑猪H-FABP基因进行SNPs快速筛查及其编码区蛋白质功能预测。结果表明,甘肃黑猪H-FABP基因编码区全长402 bp,编码133个氨基酸残基,共检测出4个SNPs,分别为C⁷³⁴T-Intron1、T¹⁵²C-Exon2、G³⁰A-Intron2、T¹²¹G-Intron2,其中T¹⁵²C-Exon2为错义突变,氨基酸由原来的异亮氨酸(Ile)转变为苏氨酸(Thr)。生物信息学预测发现,甘肃黑猪H-FABP蛋白是一种稳定的亲水蛋白,蛋白质二三级结构均以β-折叠为主的混合型蛋白。