腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA对马铃薯甲虫幼虫毒力测定

[目的]测定已验证的腺苷高半胱氨酸水解酶基因的dsRNA对马铃薯甲虫各龄期幼虫的毒力,为RNA干扰在马铃薯甲虫防治中的具体应用条件.[方法]采用饲喂法,将不同剂量马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA(dsSAHase)导入马铃薯甲虫体内,运用线性回归方法测算各龄期LC50;观测饲喂后成虫的产卵数,解剖观察雌成虫卵巢发育情况.[结果]dsSAHase对马铃薯甲虫各龄期幼虫1龄,2龄,3龄和4龄的LC50分别为2.341、2.552、3.450和4.968 μg/mL.[结论]dsSAHase对马铃薯甲虫幼虫具有显著致死作用、拒食作用以及抑制生长发育作用,各龄期幼虫的毒力随龄期增长而降低,其中对1、2龄幼虫毒力与对3、4龄幼虫毒力差异显著.     

温度对马铃薯甲虫分布的影响——以新疆吐鲁番地区 夏季高温对其羽化的影响为例

【目的】明确马铃薯甲虫至今未在新疆吐鲁番地区定殖是否与温度有关,以及温度在其扩散中的作用,为中国马铃薯甲虫的持续防控提供依据。【方法】以马铃薯甲虫4龄幼虫为研究对象,在不同温度条件下处理不同时间后观察羽化情况,得出马铃薯甲虫羽化耐受的临界高温,同时结合新疆历史气候资料,运用ArcGIS软件的空间分析功能,对夏季平均最高温度的空间分布格局进行研究。【结果】随着温度的升高,马铃薯甲虫4龄幼虫羽化率逐渐下降,发育历期逐渐延长;当温度达到39℃时,羽化率趋近于0,马铃薯甲虫羽化过程中耐受的临界高温为39℃,同时,该温度下耐受的临界时间为72 h。【结论】吐鲁番地区夏季持续一个月以上的39℃以上高温,阻止了马铃薯甲虫在该地成功定殖。夏季高温天气阻碍了马铃薯甲虫通过吐鲁番地区继续向东扩散,应当加强检验检疫措施,防止马铃薯甲虫通过人为携带途径继续向东扩散。     

温度和土壤含水量对马铃薯甲虫解除冬眠影响作用

[目的]以越冬马铃薯甲虫为研究对象,研究解除其冬眠的温度、土壤含水量条件,探索马铃薯甲虫的发生规律,为控制该甲虫的发生和扩散提供依据.[方法]设置不同的温度、土壤含水量梯度,记录不同温度、土壤含水量条件下马铃薯甲虫的出土情况,并进行统计分析.[结果]温度低于25℃时出土率随温度升高而升高,在25℃出现最大值,温度大于25℃时,出土率随温度升高而减小;在土壤含水量低于20;时出土率随土壤含水量升高而减小,在土壤含水量为20;附近出现最低值,土壤含水量大于20;时,解除休眠后成虫出土率随土壤含水量升高而升高.解除越冬马铃薯甲虫冬眠的最佳温度、土壤含水量组合为25℃、10;.在相同温度、土壤含水量条件下,越冬马铃薯甲虫雌成虫出土率大于雄成虫出土率.在一定温度、土壤含水量条件下,越冬马铃薯甲虫雌、雄成虫4d后开始出土.[结论]解除越冬马铃薯甲虫冬眠需要一定的温度和土壤含水量.在相同土壤含水量情况下,室温条件利于解除马铃薯甲虫冬眠.在相同温度情况下,过干或过湿的土壤环境对解除马铃薯甲虫冬眠有胁迫刺激作用.在相同温度、土壤含水量条件下,越冬马铃薯甲虫雌成虫较雄成虫易于解除休眠.在温度和土壤含水量条件适宜情况下,解除马铃薯甲虫冬眠需要一定的缓冲时间.     

马铃薯甲虫持续防控技术研究与应用

[目的]探索一套适宜于发生区生产实际的马铃薯甲虫持续防控技术,有效控制其发生、危害及传播.[方法]通过秋耕冬灌、轮作倒茬评价马铃薯甲虫防治效果,筛选新型化学药剂,对生物防治、防虫栽培技术和防治指标等进行研究.[结果]马铃薯甲虫秋翻越冬死亡率可达33.3;-76.4;,轮作可降低虫口基数29.4;-84.3;,推迟成虫发生期4-7d;天敌以捕食性为主,其中捕食幼虫的占总数89.2;,筛选出高效的环境友好型农药14种,药后20 d后田间防效均达90.0;以上;提出了提高马铃薯耐害性施肥技术和覆膜加滴灌栽培防治马铃薯甲虫技术,能显著提高马铃薯的耐害性,降低马铃薯甲虫为害造成的产童损失,使产量提高10.5;-24.8;;越冬代成虫和一代低龄幼虫防治指标分别为24和106头/百株.[结论]提出了适宜我国马铃薯甲虫发生区生产实际的马铃薯甲虫持续防控技术,兼备先进性、实用性和可操作性,该技术主要包括生态调控、生物防治、保健栽培和与环境相容的化学防治等,经大面积应用推广取得了显著的经济、社会和生态效益.     

不同寄主植物对马铃薯甲虫的引诱作用

随着马铃薯甲虫不断扩展其分布范围,其对寄主的适应性也在发生变化.在我国,马铃薯甲虫的主要寄主植物是马铃薯、茄子、番茄和天仙子.为进一步明确马铃薯甲虫对不同寄主植物的嗜食程度,研究了以上4种寄主植物对马铃薯甲虫的引诱作用,以及取食量的影响,同时进行了田间寄主选择性的调查.选择性试验结果表明:不同寄主植物对马铃薯甲虫的引诱作用差异显著,其中马铃薯、天仙子引诱作用显著高于茄子和番茄;取食量研究结果表明:马铃薯甲虫各龄期对不同寄主24 h取食量的大小依次为:马铃薯＞茄子＞天仙子＞番茄;1-2龄幼虫取食量小,3-4龄幼虫及成虫暴食寄主叶片,是马铃薯甲虫造成危害的主要阶段.     

马铃薯甲虫LdATPaseE调控幼虫蜕皮的分子机制

【目的】研究LdATPaseE通过类胰岛素信号通路影响保幼激素和蜕皮激素通路,调节马铃薯甲虫幼虫化蛹的分子机制。【方法】LdATPaseE cDNA序列通过马铃薯甲虫转录组数据分析和RT-PCR克隆获得;qPCR检测其在马铃薯甲虫各发育阶段,以及四龄幼虫不同组织的相对表达量;采用喂食幼虫dsRNA的方法,分析该基因在马铃薯甲虫幼虫的生长发育过程中的影响,并测定类胰岛素、保幼激素和蜕皮激素通路基因对该基因的表达响应机制。【结果】喂食二龄幼虫dsLdATPaseE后,成功敲低了靶标基因,阻止二龄幼虫的生长,显著增加了二龄幼虫的死亡率。三龄和四龄幼虫喂食dsLdATPaseE-1和dsLdATPaseE-2,在极低浓度下即敲低了靶标基因,阻止了幼虫生长,显著降低马铃薯甲虫幼虫的化蛹率。敲低LdATPaseE还显著升高了LdInR与Ld4EBP的表达量,抑制一个蜕皮激素合成基因的转录,降低20E滴度并降低了一个20E响应基因的表达。敲低LdATPaseE还抑制了一个JH合成酶基因的表达,降低了JH滴度,下调了一个JH早期响应基因的表达量。【结论】沉默LdATPaseE后,其可能通过抑制IIS信号途径,降低20E和JH的滴度、下调20E和JH信号从而影响幼虫生长和发育。     

营养对马铃薯甲虫迁飞能力的影响

[目的]研究营养对马铃薯甲虫飞行能力的影响,探索马铃薯甲虫的迁飞规律,为控制马铃薯甲虫的扩散提供依据.[方法]通过昆虫飞行磨系统测定不同营养状况下马铃薯甲虫的飞行能力.[结果]越冬代、第一代饥饿3d的马铃薯甲虫飞行能力最强;第二代马铃薯甲虫饥饿1d时的飞行能力最强.[结论]短时间的营养缺乏容易造成马铃薯甲虫的迁飞,长时间营养不足导致马铃薯甲虫迁飞的能量少,飞行能力弱.     

马铃薯甲虫烟碱型乙酰胆碱受体α5亚基基因的克隆及其表达模式分析

[目的]烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)在昆虫中枢神经系统兴奋性神经递质突触传导过程中起重要作用,也是新烟碱类杀虫剂的作用靶标。马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)是重要的检疫性马铃薯食叶害虫。根据报道已鉴定得到该虫10个nAChR亚基,本研究的目的是进一步完善该虫nAChR亚基的组成和其表达模式。[方法]依据马铃薯甲虫基因组数据,利用PCR和RACE技术对马铃薯甲虫的nAChR亚基基因进行克隆,通过相似性和系统发育树分析验证该基因的亲缘关系。利用实时定量PCR技术检测该基因在马铃薯甲虫各个发育阶段及成虫头、胸、腹和吡虫啉及噻虫嗪处理的4龄幼虫和成虫的表达水平。[结果]克隆获得了该虫又1个nAChRα亚基基因的全长cDNA,将其命名为Ldα5(GenBank登录号为MF197919)。实时定量PCR结果表明:Ldα5在马铃薯甲虫各个发育阶段及成虫头、胸、腹中都有不同程度的表达量,其中在1龄幼虫和成虫头部的表达量最高;吡虫啉和噻虫嗪处理对Ldα5的表达量有不同影响,在幼虫中,吡虫啉导致Ldα5明显下调,而噻虫嗪无明显影响,在成虫中2种药剂的处理都可明显提高Ldα5的表达量。[结论]本研究结果为明确马铃薯甲虫nAChR亚基的生理功能及该虫对新烟碱类杀虫剂的抗性机制等研究奠定了基础。     

马铃薯甲虫RNA干扰高效致死基因的筛选

【目的】基于备选基因RNA干扰后的致死效果评价,筛选出高效致死基因。【方法】通过在赤拟谷盗中已的报导和相似性搜索获得马铃薯甲虫致死基因Ldpp1alpha-96a、LdRpt3、Ldalpha snap、LdSrp54k、LdRpn6、LdRop、LdGawky、Ldshi、Ldcact、Ldinr-a,以及阳性对照基因LdATPaseA和LdATPaseE,构建dsRNA表达载体,经饲喂马铃薯甲虫二龄幼虫不同浓度的dsRNA,分析对幼虫的20%取食剂量AD₂₀、化蛹中量PD₅₀和幼虫7 d致死中量LD₅₀ ,经分析和评估,筛选出高效致死基因。【结果】12个基因的dsRNA对马铃薯甲虫幼虫的 AD₂₀ 在1.18±0.10(μg / mL)~ 61.07±10.17(μg / mL);PD₅₀ 在0.06 ±0.01(μg / mL)~ 31.20 ±1.89(μg / mL);LD₅₀ 在1.39±0.13(μg / mL)~ 228.13±6.72(μg / mL)。其中 AD₂₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、LdRpn6 ;PD₅₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、LdGawky;LD₀ 最高与最低的基因分别为Ldinr-a、Ldsrp54k。【结论】12个基因的dsRNA对马铃薯甲虫幼虫均有一定的抑制取食、抑制化蛹及致死活性。其致死活性随浓度增高而增大,表现出剂量依赖效应,与对照组存在显著差异。通过综合比较AD₂₀和LD₅₀,Ldalpha snap、LdRpn6、LdSrp54k、LdRpt3个基因的毒力较ATPaseE和ATPaseA更强,具有较高的生物活性。提出并推荐AD₂₀和LD₅₀是评价备选基因dsRNA对幼虫致死效果的关键指标。     

光滑鳖甲Anatolica polita 抗冻蛋白基因的发育阶段性表达以及低温对其表达的影响

[目的]光滑鳖甲是广泛分布于新疆荒漠地区的一种拟步甲科(Tenebrionidae)昆虫,它能够通过抗冻蛋白的表达从而在长时间低温和剧烈的温度变化等环境条件下生存.研究光滑鳖甲抗冻蛋白基因(Apafp)在不同发育阶段表达差异和冷胁迫对其表达的影响.[方法]通过实时定量PCR方法对Apafp752和Apafp914两种抗冻蛋白基因的mRNA水平变化规律进行了研究.[结果]随着幼虫龄期的增大,Apafps mRNA水平逐渐增加,至8～9龄幼虫阶段达到最高约为小龄幼虫的7～8倍,蛹期时则显著降低.血淋巴液的渗透浓度值也呈现相同趋势.[结论]发育阶段的变化是对光滑鳖甲抗冻蛋白基因表达的重要调节因素.在低温胁迫下4～6龄幼虫afps的表达显著提高,说明冷胁迫能促进幼虫afps的累积.结合Apafps基因表达和低温存活率可以推测光滑鳖甲大龄幼虫可能是一种过冬虫态.     

我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA分析及一种dsRNA病毒的鉴定

【目的】苹果斑点落叶病在我国各苹果主产区均有发生,给苹果产业造成了严重的经济损失。苹果斑点落叶病是由链格孢苹果专化型（Alternaria alternata f. sp. mali）侵染引起的一种气传病害。本研究旨在探明我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA的情况,为田间防治斑点落叶病提供新的生防资源,并为病毒的多样性以及进化研究提供新的认识。【方法】从全国8个省份采集有典型症状的组织样本,通过组织分离和单孢分离法获得纯培养;通过dsRNA的提取及凝胶电泳明确我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA的情况;通过菌株培养特性、菌丝生长速率、在果实及叶片上的致病力测定揭示携带dsRNA病原菌的生物学性状;通过高通量测序技术、分子克隆技术对QY-2菌株携带的dsRNA病毒进行全基因组序列、基因组结构和系统进化分析。【结果】自我国苹果产区获得102株苹果斑点落叶病菌菌株的纯培养,通过dsRNA的提取及凝胶电泳明确了5个菌株带有明显的dsRNA条带,携带的dsRNA分为4种类型,类型I（菌株YT-3-7）dsRNA在8、2.5和1.5 kb左右;类型II（菌株SJZ-4）dsRNA在8 kb左右;类型III（菌株QY-2）dsRNA在3和0.8 kb左右;类型IV（菌株CL-2-6和SQ-1-1）dsRNA在2.5和1.5 kb左右。含有dsRNA的菌株培养性状多样,菌落特征、生长速率与dsRNA携带与否及类型没有明显的关系,含有dsRNA的菌株大多属于弱致病力菌株。QY-2在叶片和果实上的致病力均最弱,确定其携带的dsRNA病毒基因组包括5个dsRNA片段,分别为dsRNA1—dsRNA5,片段大小依次为3 665、3 054、2 824、2 819、831 nt,提交至GenBank,登录号分别为MK672910、MK672913、MK672912、MK672911、MK836314。编码蛋白的分子量依次为124、83、84、83、13 kD。经系统进化关系分析,与Alternaria alternata chrysovirus 1遗传关系最近,确定其为产黄青霉病毒科（Chrysoviridae）、β产黄青霉病毒属（Betachrysovirus）的Alternaria alternata chrysovirus,暂定命名为Alternaria alternata chrysovirus 2（AaCV2）。【结论】我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA群体多样,dsRNA的有无及类型与寄主病原菌培养性状没有明显相关性,携带dsRNA的菌株多为弱致病力菌株,致病力最低的QY-2菌株携带AaCV2。该菌株的弱致病力可能具有潜在的应用价值,可为苹果斑点落叶病提供新的生防资源。     

双链RNA技术与植物病毒研究

 90%以上的植物病毒基因组是RNA。含RNA基因组的病毒会产生特异的双链RNA（dsRNA）。从受到病毒侵染的植物组织中提取病毒相关的dsRNA，进行病毒的检测和分类，诊断植物病毒病，探索生物防治植物病毒病的新途径，是植物病毒研究的重要内容。本文就双链RNA技术在植物病毒研究中的应用做一综述。     

一种实用的双链RNA病毒基因组克隆方法

以克隆水稻矮缩病毒(Rice dwarf virts,RDV)基因组片段S11、S12为例,报道一种克隆植物dsRNA病毒基因组的方法.具体过程为:利用T4 RNA连接酶将5′-磷酸、3′-氨基修饰的引物Primer 1连接到RDV病毒基因组第11、12片段dsRNA的3′-OH端,经逆转录、退火、补齐形成全长双链cD-NA,使用单一的互补引物Primer 2进行PCR扩增,扩增产物克隆在pMD 18-T载体上,对重组子进行两次限制性内切酶分析,结合序列测定分离鉴定S11、S12.结果表明,这种方法能同时克隆RDV基因片段S11、S12,是一种有效实用的dsRNA病毒基因组克隆方法.     

草莓植株中病毒dsRNA的分离和鉴定

 【目的】病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础，本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法，获得草莓主要病毒的部分基因组序列。【方法】采用改进的dsRNA分离方法，对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsRNA进行分离，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。【结果】不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同，试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶，而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。dsRNA对DNase Ⅰ具有很强的耐性；当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl时，dsRNA对RNase A具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒，能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。应用RT-PCR技术，从凝胶回收的dsRNA及DNase Ⅰ/RNase A两酶酶解处理后的dsRNA中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。【结论】建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsRNA的完整技术体系，为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。     

OsWRKY10基因特异性dsRNA干涉载体构建

[目的]明确Osdg中T-DNA插入位点的基因是否为引起突变表型的基因。[方法]采用OsWRKY10基因5’端、不含WRKY保守域的长300 bp的cDNA片段,构建抑制OsWRKY10基因表达的特异性dsRNA干涉重组表达载体pCam-35SWInW。采用冻溶法将pCam-35SWInW载体导入根癌农杆菌超毒力菌株EHA105,对其进行PCR检测。[结果]该研究成功构建了重组表达载体pCam-35SWInW。采用相应限制性内切酶对重组表达载体进行酶切鉴定,其中以XhoⅠ消解重组质粒,可获得1 kb左右的DNA片段。在抑制基因表达方面,发卡结构比反义结构更为有效。[结论]该研究成功构建了抑制OsWRKY10表达的特异性dsRNA干涉载体,可用于进一步的基因功能研究。     

稻瘟病菌dsRNA病毒筛选及其对寄主的影响

应用纤维素吸附法对60个稻瘟病菌株进行真菌病毒筛选,发现14个菌株含有ds RNA病毒。对带毒菌株GD45通过利巴韦林–高温结合方法得到衍生脱毒菌株GD45–4,与带毒菌株相比,其菌丝更为饱满、菌丝较直,在PDA平板上菌落形态显得更为蓬松,颜色偏白。推测菌株GD45 ds RNA病毒消除后会对其表现型产生一定影响。     

植物病毒源dsRNA原核表达条件的研究

利用PVYN-CP和PLRV-CP基因构建了dsRNA原核表达载体L4440RYl,转至大肠杆菌HT115(DE3),获得菌株HTRYl。绘制了菌株HTRYl的生长曲线,研究了IPTG浓度和诱导时间对该菌株dsRNA表达量的影响。结果表明,接种3.5h,菌体浓度OD600为0.6,加入终浓度为0.3～0.4mmol/L的IPTG,诱导4～5h时,dsRNA表达量最高。dsRNA表达条件的研究,为dsRNA的应用研究奠定了基础。     

双链RNA分析技术在鉴定RNA病毒中的应用

ｄｓＲＮＡ技术是以无ＲＮＡ病毒或类似病毒因子侵染的植物组织中不含有容易鉴定的同原大分子的ｄｓＲＮＡ（＞０．１×１０６）存在为前提。在植物体内ｄｓＲＮＡ是ＲＮＡ病毒和类病毒因子存在的迹象，ｄｓＲＮＡ包括ｄｓＲＮＡ病毒的基因或ｓｓＲＮＡ病的复制中间型。ｄｓＲＮＡ在寄主组织相当稳定，可以用物理和化学的方法分离出来。叙述了ｄｓＲＮＡ技术用于植物病毒群、成员、同一病毒的不同株系、感染作物的新病毒及其复合侵染、类病毒、卫星病毒等的鉴定。证明该方法使用广泛、快速准确，不需要贵重设备，在一般实验室中即可进行。该方法有重要应用和学术价值，已引起植物病毒和植物病理学工作者广泛兴趣。     

家蚕核型多角体病毒ie-2基因dsRNA表达载体的构建

为了研究ie-2基因的dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果,根据NCBI公布的BmNPV(T3株)基因组序列,克隆了BmNPV极早期表达因子ie-2.将该基因用亚克隆的方法导入到L4440载体中构建L4440-ie-2,并成功转入大肠杆菌HT115(DE3).IPTG诱导可以成功表达相应的dsRNA.