ICR小鼠胚胎干细胞的分离与培养

为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响,试验以12.5～13.5 dICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5 d ICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响.结果表明:采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69.0%)均...     

昆明系小鼠胚胎干细胞分离培养的优化

以昆明系小鼠为对象,经过丝裂霉C处理成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)制备饲养层,对影响小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)分离培养的相关因素进行研究。分别收集小鼠3.5d的囊胚(扩张囊胚)和4.5d囊胚(孵化囊胚)进行培养,比较扩张囊胚和孵化囊胚的贴壁率、原代克隆率及传代率的情况。收集3.5d胚龄的囊胚,通过全胚法和免疫外科法对内细胞团(Inner cell mass,ICM)进行分离培养ICM集落,确定离散ICM的适宜时间。用0.25%胰酶+0.04%EDTA,0.125%胰酶+0.02%EDTA和0.25%胰酶+1%小鸡血清等方法对小鼠ES细胞集落进行传代,观察不同酶浓度对ES细胞分离克隆的影响。结果显示,孵化囊胚的贴壁率高于扩张囊胚(P0.05),但传代率则相反(P0.05),原代克隆率差异不显著(P0.05);一般ICM增殖培养2～3d(免疫外科法)或4～5d(全胚培养法)后,出现典型的克隆集落,再挑取ICM;0.125%胰酶+0.02%EDTA及0.25%胰酶+1%小鸡血清,形成ES原代克隆率较高,2组没有显著性差异(P0.05);结果表明,分离得到的ES细胞经形态学观察,AKP染色,体外分化试验等表明其具有胚胎干细胞的特性。     

ICR小鼠胚胎干细胞的分离与培养

为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响,试验以12.5~13.5 d ICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5 d ICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响。结果表明:采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69.0%)均比含15%KSR、5%FBS+10%KSR的细胞培养液高(42.9%,28.6%;75.0%,54.2%),ES细胞最高传至6代;培养液中添加10 ng/mL LIF+10 ng/mL SCF的效果比单独添加1种因子的效果好,最高传至6代,高于单独添加1种因子的传代数(4代,2代);用3种传代方法进行传代时,采用差异贴壁法传代效果最佳,最高传至8代,酶消化法传至4代,机械加酶消化法传至6代。     

无血清分离昆明系小鼠胚胎干细胞

以昆明系小鼠胚胎为研究材料,以丝裂霉素C处理的胎鼠成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）为饲养层,在胚胎干细胞（Embryonic stemcells,ESCs）培养液中添加血清替代物（Knockout serumreplacement,KSR）以替代胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）,并与添加FBS的培养液进行对比,研究了昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM（Inner cell mass,ICM）集落形成以及ESCs分离的情况。结果表明,在添加KSR的培养液中,胚胎在培养3~5 d贴壁,胚胎贴壁率显著低于添加FBS的培养液;5~7 d形成ICM集落,集落未分化形态可维持2~3 d,培养10 d ICM集落仍可保持典型的未分化形态;ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率与添加FBS的培养液相比差异不显著（P〉0.05）,但2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的培养液,其中有2株ESCs在添加KSR的培养液中传到7代;所分离细胞显示碱性磷酸酶染色强阳性,Oct-4、Nanog的免疫组化染色阳性,具有ESCs的特点。结论：在ESCs培养液中添加KSR比添加FBS更有利于维持ICM集落及ESCs的未分化状态。     

昆明小白鼠胚胎干细胞分离培养的影响因素

为了研究影响胚胎干细胞(ESC)体外分离克隆的因素,试验采用3~5日龄大鼠心肌细胞制成心肌细胞条件培养基(RH-CM),比较了4种培养体系对小鼠胚胎干细胞体外培养的影响,并分析比较了不同饲养层对胚胎干细胞分离克隆造成的影响。结果表明:添加重组鼠白血病抑制因子和心肌细胞条件培养基在胚胎贴壁率、内细胞团(ICM)形成率和原代胚胎干细胞集落形成率以及抑制分化的过程中起到的作用显著优于未添加任何诱导成分的培养基;作为饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养胚胎干细胞的效果优于小鼠睾丸支持细胞(MS)。     

昆明小鼠胚胎收集时间和培养液对囊胚内细胞团集落分离培养的影响

本研究旨在筛选获取优质ICM集落的实验方法。以昆明系小鼠为实验动物,采集3.5、4 d和4.5 d的胚胎,分别移入DMEM培养液、DMEM+白血病抑制因子(LIF)和小鼠胎儿成纤维细胞共培养体系中进行培养,观察比较内细胞团(ICM)从透明带中孵出的时间、孵化囊胚贴壁情况以及ICM集落形成情况。结果表明:妊娠3.5 d的胚胎61%为桑椹胚,需要经过4～5 d的体外培养才能形成ICM集落;妊娠4 d的扩张囊胚经过3～4 d的共培养后形成ICM集落;妊娠4.5 d的孵化囊胚经过1～2 d的共培养即可形成ICM集落;ICM形成率以妊娠4.5 d的胚胎最高,显著高于妊娠4 d和3.5 d的胚胎(P<0.01),但妊娠4.5 d冲出孵化囊胚数量显著降低(P<0.01);小鼠胎儿成纤维细胞共培养体系优于DMEM和DMEM+LIF培养液。因此,采集妊娠4 d的昆明小鼠胚胎,选择小鼠胎儿成纤维细胞共培养体系,在体外培养3～4 d,能够有效分离培养出可用于胚胎干细胞研究的优质ICM。     

昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化

为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞,本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×104、1×105、1×106·mL-1密度接种,以H-DMEM+15%KSR+LIF为培养液,观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)生长的影响,并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(SCF)、SCF+胰岛素对昆明小鼠ES细胞分离克隆的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105·mL-1的饲养层上,F1代和F2代ES细胞克隆形成率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(P<0.05),培养液中添加SCF显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(P<0.05),同时添加SCF和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞克隆形成率。所分离的ES细胞显示AKP染色强阳性,Oct-4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性,具有ES细胞的特点。由此认为,发育至囊胚的胚胎在MEF密度为1×105·mL-1上,培养液中同时添加SCF和胰岛素更适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。     

ICR小鼠胚胎干细胞建系初步研究

实验旨在探讨消化方式和胚胎发育阶段对ICR小鼠胚胎干细胞(ES细胞)建系效率的影响。ICR小鼠3.5 d囊胚在饲养层上贴壁后采用单一酶消化或机械化与酶消化法相结合分离隆起的细胞集落,进行传代培养;然后选择二者中较优消化方式对不同发育时期囊胚所形成的细胞集落进行处理。结果表明:采用机械化与胰酶消化相结合的方式,形成的类ES细胞超过7代的比率(85.0%)要显著高于单一的胰酶消化(15.0%)(P<0.05);当用二者相结合的方式对ICR小鼠3.5 d(早期囊胚)、4.0 d(扩张囊胚)和4.5 d(孵化囊胚)所形成的细胞集落进行消化传代培养,三者在贴壁率和形成原代细胞集落率上均无显著差别(P>0.05),但传代超过7代的效率上早期囊胚和扩张囊胚均高于孵化囊胚(P<0.05)。结果提示,采用机械化与酶消化法相结合更适合于3.5～4.0 d ICR小鼠囊胚的ES细胞建系。     

饲养层和生长因子对山羊类胚胎干细胞的影响

实验以6~8 d的山羊囊胚为实验材料,采用机械法分离山羊囊胚ICM,分别以小鼠和山羊胚胎成纤维细胞作饲养层,并采用含不同生长因子的培养液进行培养,比较了饲养层和生长因子对分离培养山羊类ES细胞的影响。结果表明:采用MEF饲养层其ICM增殖率优于GEF饲养层;与对照组相比,培养液中添加LIF及SCF或胰岛素对山羊ICM的贴壁增殖及传代都有积极影响;以MEF为饲养层,培养液中同时添加LIF和SCF时,培养山羊类ES细胞的效果最佳,传至3代。     

小鼠胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代研究

对影响小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES细胞）培养、克隆、分离、传代效果的因素进行了探索研究。应用223枚昆明白小鼠胚胎和20枚129品系小鼠胚胎的研究结果表明，129品系小鼠胚胎比昆明白小鼠胚胎更适合作为ES细胞建系的材料，两者FS出现率差异显著（P＜0．05）；以DMEM＋10％NBS＋10％FCS为基础培养液，分别加入LIF、胰岛素、LIF＋SCF，极显著提高昆明白小鼠胚胎贴壁率，ICM生长率及F1、F2出现率（P＜0．01），而在DMEM＋10％NBS＋10％FCS＋LIF＋SCF为培养液，得到昆明白小鼠胚胎最高贴壁率、ICM生长率及传代率；4dpc胚胎传代情况显著好于3．5dpc胚胎（P＜0．05）。     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

目的：探索不同浓度的丝裂霉素c（MMC）处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法：取13．5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论：胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;MMC能有效抑制胎儿成纤维细胞的增殖,最佳处理方法为20μg／ml、2h。妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在10、20μg／mlMMC处理的饲养层上孵出率和贴壁率显著高于5／Lg／mlMMC处理的饲养层,在5、10和20μg／m[MMC处理的饲养层上,内细胞团增殖率无显著差异。因此,ICR小鼠胚胎成纤维细胞最佳处理方法为20μg／mlMMC作用2h。     

某些因素对牛和小鼠类胚胎干细胞分离与培养的影响

以荷斯坦牛胚胎和小鼠胚胎为材料 ,研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离 ;在 ES细胞分离与克隆中 ,以 15 %～ 2 0 %犊牛血清为宜 ,在 DMEM(L)培养基中添加 0 .1μmol/LNa2 Se O3 0 .1mmol/Lβ-巯基乙醇 10 μg/L IGF 10 0 0 IU/m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;在TCM199、DMEM(高糖 )和 DMEM(低糖 ) 3种培养基中 ,低糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离 ;优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在 37℃用低浓度消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 ,ES细胞克隆效率最高。     

表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响

为了观察不同浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响,试验将小鼠原核期胚胎用链霉蛋白酶去除透明带后,分别置于含有不同浓度的表皮生长因子无血清胚胎体外培养液中培养,观察各期胚胎的发育情况.结果表明:除0.01 ng/mL表皮生长因子添加组胚胎的2细胞发育率和囊胚回收率与添加0.1 ng/mL表皮生长因子处理组差异不显著外(P>0.05),其体外胚胎各期的发育率、囊胚回收率和囊胚细胞数与其他处理组比较均差异显著(P<0.05).说明一定浓度的表皮生长因子可以提高无透明带小鼠胚胎体外培养各期的发育率,但是高浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎的体外发育有一定的抑制作用.     

提高猪囊胚后期贴壁能力的优化培养体系

为了提高猪孤雌囊胚贴壁率,试验从饲养层及培养液两方面研究猪孤雌囊胚贴壁能力;用小鼠、猪和牛的胎儿成纤维细胞制作饲养层,分别添加DMEM、NCSU-23、DMEM/NCSU-23培养液,探讨猪孤雌囊胚在3种饲养层上的发育效果。结果表明,BEF饲养层能更好地促进猪孤雌囊胚贴壁生长,其囊胚贴壁率为33.67%,与MEF饲养层组的囊胚贴壁率(19.08%)之间差异显著(P0.05),与PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05),MEF饲养层组和PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05);在BEF牛胎儿成纤维细胞饲养层组,用猪胚胎培养液NCSU-23培养猪孤雌囊胚后,囊胚贴壁率(22.53%)显著高于DMEM培养液组(10.41%)和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组(12.05%)(P0.05),DMEM培养液组和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组之间差异不显著(P0.05)。牛胎儿成纤维细胞饲养层和猪胚胎培养液NCSU-23能更好地促进猪孤雌囊胚后期贴壁。     

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究.(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后.用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况.(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上.观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况.结果显示:囊胚在密度为1 × 106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×104/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05).结果表明:以1×104/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用.     

精子不同处理和胰岛素不同浓度对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精的影响

探讨了分别使用新鲜、冷冻和超声波断尾精子以及在胚胎培养液中分别添加不同浓度胰岛素对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精(ICSI)胚胎早期发育的影响.结果:(1)使用冷冻解冻精子与新鲜精子相比对猪卵母细胞ICSI后的卵裂率和囊胚率均无显著影响(P＞0.05);2)精子断尾与否对猪卵母细胞ICSI后的分裂率和囊胚率没有显著影响(P＞0.05);3)在胚胎培养液中添加5 mg/L胰岛素与对照组相比可显著提高猪ICSI胚胎的囊胚发育率(18.22% vs 3.60%,P＜0.05).     

不同抗氧化剂对鸡胚盘细胞冷冻效果的影响

为探究不同抗氧化剂对鸡胚盘细胞(blastodermal cells,BCs)冷冻保存效果,试验在冷冻液中分别添加不同浓度的N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和番茄红素(lycopene,LP)3种抗氧化剂,用胚胎程序冷冻仪冻存BCs,解冻后测定细胞活率(简称"活率"),并于培养24h后测定细胞贴壁率(简称"贴壁率")。结果表明:在活率上,除了0.05mol/L NAC组(76.7%)与800U/mL CAT组(77.3%)极显著低于对照组外(P0.01),其余各组与对照组差异均不显著(P0.05);在贴壁率上,除了800U/mL CAT组(34.2%)极显著低于对照组(P0.01)外,其余试验组均极显著高于对照组(P0.01),其中NAC、CAT与LP的最佳浓度,分别为0.01mol/L(48.3%)、200U/mL(45.4%)与0.05g/L(39.8%)。因此,在冷冻液中添加适量的NAC、CAT或LP,可以提高BCs冷冻保存活率(差异不显著),极显著提高解冻BCs培养24h后的贴壁率。     

SC1(pluripotin)对昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的影响

比较了在无血清培养体系中分别添加小分子化学物质pluripotin(SCl)和白血病抑制因子(LIF)对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用,并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度.以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)为饲养层,以含LIF的添加血清替代品(KSR)的培养基(ESC-SR)为对照,分别用SC1浓度为0.3、1、3μmol/L的ESC-SR培养液对昆明小鼠胚胎进行分离培养.结果显示:胚胎在添加3 μmol/L SC1的ESC-SR培养液中ICM形成率显著高于对照组(P＜0.05),形成的ES集落与对照组形态差异不明显,最高传至第7代,并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态.不同浓度SC1培养液中,胚胎在SC1浓度为0.3 μmol/L组的F2代形成率显著高于1 μmol/L组和3μmol/L组(P＜0.05),所分离的细胞AKP染色呈阳性,Oct4、Nanog和Sox2的免疫荧光染色均显阳性,具有ES细胞的特点.结果表明,ESC-SR培养液中SC1可以替代LIF用于小鼠ES细胞未分化状态的维持,并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养.     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

<正>目的:探索不同浓度的丝裂霉素C(MMC)处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法:取13.5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3.5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论:胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素(AX)对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23～25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率(P0.05);显著提高囊胚的细胞数(P0.05);极显著提高TGF-β基因表达量(P0.01)。结果表明,添加10μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。