猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ受体基因的克隆与序列分析

为研究猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ的生物学功能,本研究应用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞总RNA中克隆出猪FcγR Ⅲ的cDNA序列,并对其进行了分析。结果表明,克隆到的序列长820 bp,包含有1个771 bp完整开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的猪FcγR Ⅲ序列(AF237453)的核苷酸同源性为99.9％;与人、牛、马、绵羊、猕猴、狗、猫、小鼠氨基酸同源性分别为61.6%、62.9%、55.3%、62.2%、63.0%、59.0%、61.8%和53.2%;蛋白质分子结构预测结果表明,该分子由信号肽（20个氨基酸）、胞外区(185个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(28个氨基酸)组成,在胞外区存在2个Ig样结构域。猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ基因的成功克隆,为进一步研究其结构与功能奠定基础。     

猪Fc_γRⅡb亚型(Fc_γRⅡb1)基因的分子克隆及鉴定

IgG Fc受体(FcγRs)的一个主要效应机制是可结合IgG免疫复合物发生反应。目前已鉴定出的FcγRs有4类:高亲和力的FcγRⅠ(CD64),中等亲和力的FcγRⅠ、FcγRⅡ(CD32),以及低亲和力的FcγRⅢ(CD16)。人FcγRⅡ主要有FcγRⅡa、FcγRⅡb、FcγRⅡc 3个亚型;小鼠有1个亚型FcγRⅡb;牛有2个亚型FcγRⅡb、FcγRⅡc。人、小鼠、牛中FcγRⅡb又包括2个亚型:FcγRⅡb1(b1)和FcγRⅡb2(b2),但有关猪FcγRⅡb亚型的研究鲜有报道。本研究对猪FcγRⅡb亚型(FcγRⅡb1)进行了分子克隆、测序及鉴定,并运用RT-PCR从猪外周血白细胞RNA中扩增出猪FcγRⅡb1cDNA序列。结果发现,猪FcγRⅡb1cDNA序列包含一个951bp的开放阅读框(ORF),可编码316个氨基酸跨膜糖蛋白,包括两个免疫球蛋白(Ig)样胞外结构域,一个跨膜区域,一个带有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的胞质尾区。猪FcγRⅡb1cDNA序列与DQ026064同源性为98.3%,其在胞质尾区有一19个氨基酸的插入框。荧光免疫试验结果发现,猪FcγRⅡb1cDNA序...     

绵羊IFN-γ基因的克隆与序列分析

将无菌采集的绵羊(湖羊)脾脏淋巴细胞进行体外培养,利用刀豆蛋白(ConA)刺激24 h后提取总RNA,采用RT-PCR扩增绵羊IFNγ-基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,经PCR和双酶切鉴定后进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长554 bp,包含501 bp开放阅读框,编码166个氨基酸,分子质量约为18.4 ku。克隆的绵羊IFNγ-基因与GenBank上已公布的人、牛、山羊、马鹿、马、骆驼、猪、狗、猫和鸡的IFNγ-核苷酸序列进行比较,其同源性分别为75.2%,96.6%,99.0%,95.8%,83.0%,88.8%,86.6%,82.4%,53.9%和32.9%,与其他品种绵羊的核苷酸同源性为100%;氨基酸序列同源性分别为61.7%,94.6%,98.2%,92.2%,77.8%,86.8%,77.8%,76.0%,39.5%和6.7%,这为进一步研究绵羊IFNγ-基因的表达、生物学活性和应用奠定了一定基础。     

广西水牛γ干扰素基因的克隆与序列分析

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.     

猪FcγRⅢ双抗体夹心ELISA方法的建立及其在PRRSV感染猪中的初步应用

利用自行制备的FcγRⅢ多克隆抗体作为捕获抗体,鼠源抗FcγRⅢ特异性单克隆抗体作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠Ig G作为检测系统,建立了检测可溶性FcγRⅢ(s FcγRⅢ)水平的双抗体夹心ELISA方法。利用建立的该ELISA方法对感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)血清进行检测,结果显示,猪感染PRRSV后,血清中s FcγRⅢ的水平明显增高,因此s FcγRⅢ的水平可能作为PRRSV感染的预警标志。该研究结果为进一步阐释FcγRⅢ在PRRSV感染中发挥的作用奠定了基础。     

猪IFN-γ基因的克隆与序列分析

猪IFN-γ具有强烈的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，作为生物药荆和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT—PCR技术成功克隆了猪IFN-γ基因。序列分析表明，克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。该基因的成功克隆为IFN-γ的进一步研究和开发奠定了基础。     

长白猪γ-干扰素基因的克隆与序列分析

将长白猪外周血淋巴细胞进行体外培养,在ConA的刺激下培养8h～24h后,提取培养的淋巴细胞的总RNA,应用RTPCR技术扩增淋巴细胞γ干扰素cDNA,并将其克隆到pGEMT载体上,进行测序。序列测定结果表明,克隆获得的IFNγ基因全长为534个碱基,ORF为501个碱基,编码166个氨基酸,分子质量为19.4ku。此基因与我国藏猪、成华猪以及GenBank上发表的猪IFNγ基因的核苷酸同源性均为100%,并且在氨基酸水平上也完全一致。说明几种我国地方猪IFNγ在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差异和突变,同时也证实了长白猪干扰素γ基因的正确、完整克隆。     

延边白鹅γ干扰素基因的克隆及序列分析

为了研究延边白鹅γ干扰素的生物学特性,本试验采用刀豆素（ConA）刺激延边白鹅外周血淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法扩增鹅γ干扰素基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列和序列分析。结果显示,延边白鹅γ干扰素基因全长495bp,经序列比对发现,克隆到的延边γ白鹅干扰素基因（JX966250）与哈尔滨鹅γ干扰素基因（AY524421）核苷酸序列同源性高达100%,与广东狮头鹅（EU030377）核苷酸序列同源性达99.6%,而三者的氨基酸同源性为100%。本试验成功克隆到延边白鹅γ干扰素基因,为进一步研究鹅干扰素的分子生物学特性和抗病毒作用机理奠定了基础。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

GM-CSF在机体免疫系统中发挥重要的免疫调节作用.用PHA与LPS体外联合刺激猪外周血单个核细胞,采用RT-PCR技术成功克隆了猪GM-CSF基因.序列分析表明,该序列与NCBI/GenBank上登载的序列有两个碱基不同;将猪与人、牛、羊、狗、猫、鼠等动物的GM-CSF基因序列相比较,其一致性分别为82.1%、85%、88.1%、82.8%、83.7%、70.5%,在氨基酸水平上一致性为70.3%、70.9%、78.1%、70.3%、71.9%、54.4%.然后利用生物信息学和分子生物学软件,对猪GM-CSF的结构进行预测,结果表明,猪GM-CSF为一结构松散的球状蛋白分子.猪GM-CSF基因的成功克隆及其编码蛋白结构的预测为开发高效、低毒且性质稳定的猪GM-CSF产品奠定了基础.     

民猪IFN-γ基因的克隆及序列分析

为了获得民猪干扰素-γ(IFN-γ)基因,并对该基因进行序列分析,试验采用RT-PCR技术,根据猪IFN-γ基因设计1对引物,从刀豆素A(ConA)活化的民猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,获得了长度为502 bp的片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。结果表明:民猪IFN-γcDNA长度为502 bp,IFN-γ基因的开放阅读框大小为501 bp,编码166个氨基酸,含有2个潜在N-糖基化位点;民猪IFN-γ基因与藏猪、贵州白香猪、成华猪和梅山猪等的同源性为100%。     

牛γ-干扰素基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布的牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因序列设计引物,应用一步法逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以从牛外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,扩增出γ-干扰素成熟肽基因片断,并对其进行了克隆、测序及序列分析.结果表明,试验所设计引物可以成功用于扩增牛γ-干扰素成熟肽基因片段,所扩增序列与GenBank中已有序列同源性达99.77%.     

猪FcγRⅠ真核表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立

本研究旨在建立稳定表达猪FcγRⅠ的Marc-145细胞系。从猪肺泡巨噬细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得猪FcγRⅠ和γ链cDNA,并分别构建PIREShyg3-γ和pcDNA3.1-FcγRⅠ真核表达质粒;用脂质体共转染Marc-145细胞,经潮霉素B(300μg.mL-1)和G418(400μg.mL-1)共筛选获得稳定表达猪FcγRⅠ的细胞系;运用RT-PCR、玫瑰花环和流式细胞术对细胞系进行鉴定。结果表明成功构建了猪FcγRⅠ和γ链真核表达载体,建立了稳定表达猪FcγRⅠ的细胞系,且表达于转染细胞表面的poFcγRⅠ受体分子能与猪IgG特异结合。本研究为进一步研究奠定了基础。     

山羊痘病毒疫苗株γ-IFNR基因的克隆与序列分析

为了获得羊痘病毒γ干扰素受体(interferon-γ receptor,γ-IFNR)基因,用绵羊睾丸细胞培养山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55,提取其基因组为模板,设计γ-IFNR基因特异性引物并进行PCR扩增,将其产物克隆至pGEM-T Easy载体,并进行了测序和序列分析.电泳结果显示,扩增出了2 600...     

大熊猫γ-干扰素基因的克隆与序列分析

本实验应用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫γ-干扰素基因（GenBank accession No：DQ630727）,并将其克隆到pGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定与序列分析,结果表明,经克隆得到的IFN-1基因开放阅读框由498个核苷酸组成,编码一个由166个氨基酸组成的多肽,包括编码19个氨基酸的信号肽和147个氨基酸的成熟肽,预测蛋白分子量和等电点分别约为20Ku和9．36。与GenBank中其他哺乳动物的IFN-γ基因比较,它与犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的核苷酸序列同源性在57.7％（鼠）-93．2％（犬）之间;IFN-γ编码氨基酸序列同源性在46．8％（鼠）-92．8％（犬）之间;进化树构建结果表明大熊猫与犬的遗传距离最近。     

山羊c-Myc基因的克隆及序列分析

为了克隆出山羊c-Myc基因的CDS区序列,本研究利用RT-PCR技术,参照GenBank报道的绵羊、牛、猪、马等的c-Myc基因CDS区序列设计出特异性引物,从山羊胚胎皮肤组织中扩增出山羊c-Myc CDS区序列并进行序列分析。结果表明,山羊c-Myc基因CDS区全长1320 bp （包括终止密码子）,与绵羊c-Myc基因核苷酸序列（GenBank登录号：Z68501.1）比对仅有10处存在差异,其核苷酸序列同源性为99.17%,推导的氨基酸序列同源性为99.09%;与其他物种进行同源性分析结果显示,山羊c-Myc基因CDS区与猪、狼、人、大鼠、小鼠的核苷酸序列同源性分别为91.2%、92.0%、90.2%、86.9%、86.0%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、96.1%、92.3%、91.1%、89.6%;生物信息学软件分析结果表明,山羊c-Myc蛋白产物定位于细胞核并含有HLH结构域。本研究为进一步了解c-Myc基因的功能及探讨其在山羊体细胞重编程过程中的作用奠定了基础。     

牦牛生长激素释放激素基因的克隆及序列分析

本文对牦牛GHRH基因进行PCR产物T—A克隆测序。通过GenBank中的Blastn分析表明：牦牛GHRH基因与普通牛同源性为98％，与猪同源性为89％。在所测序列中共有7个变异位点，变异率为1．6％，其核酸变异类型包括转换、颠换和插入，以转换最为常见。     

油茶SOD基因片段克隆及序列分析

摘要：根据已报道的多种植物Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因的氨基酸序列的保守区域分别设计简并引物,以油茶（Camellia oleifera）叶片总RNA为模板,通过RT PCR分别扩增得到一个375 bp的Cu/Zn SOD基因片段和一个429 bp的Mn/Fe SOD基因片段。将片段序列在NCBI网站上进行同源性比对,表明本研究克隆的结果均与多种植物的Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因存在亲缘关系,因而认为所克隆的基因片段就是油茶SOD基因;并运用DNAStar5.0软件分别进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为125个残基和143个残基;具有所有植物SOD基因共有的保守区域;与多种植物Cu/Zn SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分别在80%和84%以上,与其他植物的Mn/Fe SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在84%和86%以上。     

广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物，应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因，结果，均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到pMD18-T载体上，获得重组质粒，经PCR和EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明，广西10个地方优质品种鸡γ-干扰席基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白，分子质量约为16．8ku，与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％，氨基酸序列同源性分别为23．69／6～24．8％和97．6％～99．4％。     

环颈雉和花尾榛鸡MC4R基因的克隆和序列分析

MC4R是由下丘脑腹内侧核分泌的神经受体,参与调节动物的体重、采食量和能量稳态。根据MC4R在物种间高度保守和只含有一个外显子的特点,参考鸡MC4R序列设计引物,利用PCR法克隆了环颈雉和花尾榛鸡MC4R的全长编码区。结果表明:环颈雉和花尾榛鸡MC4R都由331个氨基酸残基组成,二者相比只有2个氨基酸的差异,都含有7个跨膜结构,具有完全相同的结构功能域,都是疏水性蛋白;同源性分析显示MC4R高度保守,鸟类间、哺乳动物间氨基酸水平的同源性都在90%以上。表明MC4R在进化过程中承受着较大的选择压力,在动物的生长发育过程中具有极其重要的作用。     

猪ESR基因一个外显子片段的克隆与序列分析

参考人、鸡、鼠的ESR基因序列，设计一对引物，采用PCR技术扩增出猪ESR基因一段DNA片段，将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR扩增和酶切分析进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。将测定的猪ESR基因的部分序列（332bp)与人、鼠、鸡的序列进行比较，结果表明：猪的核苷酸和氨基酸序列与人、鼠、鸡相比，同源性分别为90．06％和86．36％，85．54％和88．18％，74．10％和71．82％，显示了强的保守性，猪的核苷酸序列与人、鼠、鸡相比存在着4处特有变异，氨基酸序列aa25-30存在高变异区。