山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。     

山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析

将本实验室分离到的山羊痘病毒云南流行毒株MYS、XW、XD及疫苗株VF4主要结构蛋白基因P32基因克隆到PMD18T载体后进行双向测序,所得序列与Genbank中羊痘病毒属成员:山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(SLDV)参考毒株相应序列作对比分析(ByClustalWMethod),结果显示:(1)MYS、XD毒株P32基因全长969bp,疫苗株VF4为974bp,XW毒株为975bp。(2)XW、疫苗株VF4在100～105bp位置处均插入6个A,在947bp位置缺失一个T;SPPV参考毒株在169～171bp位置插入GAT。(3)由于疫苗株VF4P32基因核苷酸序列第414位置处发生了T/A突变,在该处形成一个新的终止密码子TAA,导致完整的开放读码框架(ORF)被打断,只表达第1～411bp(137个Aa)的基因片段,而不能表达出完整的P32蛋白。其余6株毒株的开放读码框架均很相似。(4)在所构建的系统发生树中,LSDV与SPPV参考毒株、MYS和XD株、VF4和XW株、GTPV参考毒株各被划分为一组。所有7个毒株P32基因核苷酸序列的同源性都很高,均在97%以上。其中疫苗株VF4与SPPV参考毒株的同源性最低,为97.6%。XD与XW毒株的同源性最高,为99.8%。(5)酶切位点分析结果显示,MYS、XW、XD、VF4及GTPV和SLDV参考毒株具有唯一的HinfI酶切位点,大约在第694bp位置。SPPV参考毒株具有2个HinfI酶切位点,分别在第391bp和691bp位置处,该酶切位点较适合用来鉴别山羊痘和绵羊痘病毒,而疙瘩皮肤病在临床上就很容易与山羊痘和绵羊痘鉴别开来。     

绵羊痘病毒ORF121基因的序列分析及其B细胞表位预测

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株ORF121基因序列,采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测ORF121蛋白B细胞表位.结果表明:4株不同绵羊痘毒株OBF121基因核苷酸序列的同源性为99%;在ORF121蛋白的肽链中,35～46、76～82、160～167区段亲水性强,35～45、54～83、90～124、130～139、144～158和160～167区段柔韧性好,37～45、112～116、129～137和143～167区段抗原指数高,33～45、78～83和159～167区段表面可及性高,30～57和151～170区段可形成一定的空间构象.结果说明ORF121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,ORF121蛋白35～45、160～167区段可能是B细胞表位优势区,具有潜在的疫苗或/和诊断价值.     

山羊痘病毒疫苗株ORF64～ORF67的分子特征

为构建胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因缺失活载体疫苗，对山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）疫苗株（AV41）ORF64-ORF67进行了克隆和序列分析。结果表明：在全长3460bp的DNA序列中，包含4个完整的开放阅读框（Open reading flame，ORF）。ORF64核苷酸序列全长396bp，编码病毒膜蛋白；ORF65核苷酸序列全长444bp，ORF64和ORF65有44个碱基重叠。ORF66核苷酸序列全长534bp，编码胸苷激酶，具有保守的ATP结合位点和细胞中TK特征序列。ORF67核苷酸序列全长594bp，编码宿主范围相关蛋白。ORF64-ORF66在脊索动物痘病毒亚科中是完全保守的。与参考的国外GPV进行序列比较，ORF64～ORF67有一些差异，如突变和插入等。同源性分析显示：与羊痘病毒属比较，核苷酸和氨基酸同源性均较高（94．7％～100％）。我国的GPV不同毒株TK同源性为100％。与脊索动物痘病毒亚科中其他成员同源性差异较大（17．3％～65．2％）。将GPV AV41TK与鸡、小鼠和人类的TK氨基酸序列进行比较，分析GPV AV41TK进化关系表明，GPVTK基因在进化上可能起源于宿主细胞的TK1基因。本研究结果显示，在分子水平上我国GPV AV41与国外毒株存在差异，推测可能是GPV AV41疫苗株在致弱过程中发生一定程度的变异。     

山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析

山羊痘是由山羊痘病毒(goat pox virus,GTPV)引起的一种急性、热性、接触性传染病,A27L蛋白是山羊痘病毒细胞内成熟病毒粒子重要的免疫保护抗原之一,为检测该蛋白诱导的特异性免疫应答,笔者等开展了山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析。结果表明:山羊痘毒株(GTPV-S-1)的ORF112基因序列与不同来源的山羊痘病毒分离株相比较,ORF112基因核苷酸序列的同源性达86.8%以上,说明山羊痘病毒的ORF112基因具有高度保守性。该结果为建立敏感、快速、准确、简单易行的GTPV检测方法和ORF112蛋白的后续研究奠定了基础。     

羊痘病毒G蛋白偶联趋化因子受体基因序列分析及其在鉴别病毒种属上的作用

为明确G蛋白偶联趋化因子受体(GpCR)基因在羊痘病毒种属鉴别中的作用,本实验对3株绵羊痘病毒(SPV)和2株山羊痘病毒(GPV)弱毒疫苗株的GpCR进行了克隆测序,并与GenBank中登录的21个羊痘病毒属成员相关序列进行了比对。核酸同源性分析表明SPV不同毒株之间同源性达到99.5%～99.8%;GPV之间同源性达到98.8%～99.8%;GenBank上公布的疙瘩皮肤病病毒(LSDV)之间同源性达到100%。而GPV、SPV和皮肤疙瘩病毒两两比对的同源性仅达到94.2%～95.9%。对GpCR的系统进化树分析可以看出GPV、SPV和LSDV分别位于不同的进化分枝上,而GPV与LSDV具有更近的亲缘关系。GpCR基因在鉴别GPV属和流行病学分析中具有重要价值。     

绵羊痘病毒ORF121基因的序列分析及其B细胞表位预测

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株ORF121基因序列,采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测ORF121蛋白B细胞表位。结果表明：4株不同绵羊痘毒株ORF121基因核苷酸序列的同源性为99％;在ORF121蛋白的肽链中,35～46、76～82、160～167区段亲水性强,35～45、54～83、90～124、130～139、144～158和160～167区段柔韧性好,37～45、112～116、129～137和143～167区段抗原指数高,33～45、78～83和159～167区段表面可及性高,30～57和151～170区段可形成一定的空间构象。结果说明ORF121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,ORF121蛋白35～45、160～167区段可能是B细胞表位优势区,具有潜在的疫苗或／和诊断价值。     

绵羊痘病毒ORFl21基因的序列分析及其B细胞表位预测

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株ORF121基因序列,采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测ORFl21蛋白B细胞表位.结果表明:4株不同绵羊痘毒株ORF121基因核苷酸序列的同源性为99%;在ORFl21蛋白的肽链中,35～46、76～82、160～167区段亲水性强,35～45、54～83、90～124、130～139、144～158和160～167区段柔韧性好,37～45、112～116、129～137和143～167区段抗原指数高,33～45、78～83和159～167区段表面可及性高,30～57和151～170区段可形成一定的空间构象.结果说明ORF121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,ORF121蛋白35～45、160～167区段可能是B细胞表位优势区.具有潜在的疫苗或/和诊断价值.     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

绵羊痘病毒固原株L2R基因的克隆与生物信息学分析

为分析绵羊痘病毒L2R蛋白的分子特征,本试验提取了绵羊痘病毒固原株（GY）的基因组DNA,设计L2R基因引物,对L2R基因进行扩增,将扩增的基因连接到pGEM-T Easy载体后转化到大肠杆菌Trans 5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行序列测序。利用生物信息学软件对L2R基因序列进行预测分析。结果显示,L2R基因序列含有一个由279个核苷酸组成的开放阅读框,编码92个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量理论值为10.92 ku,理论等电点为6.56。该蛋白质二级结构组成分别是α-螺旋占69.57%,β-折叠占9.78%,无规则卷曲占8.70%,延伸链占11.96%。多序列比对分析结果显示,不同羊痘病毒分离株L2R序列高度保守。进化树分析结果显示,GY株与NK、TU及SA株在一个分支,表明它们之间亲缘关系较近。本试验结果为进一步研究L2R蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础。     

绵羊痘病毒山东流行株的分离鉴定与T4肽基因序列分析

从山东东营疑似绵羊痘病羊的肺脏组织中分离到1株病毒。取疑似绵羊痘病羊组织病料研磨、冻融、离心后分别接种11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜和牛睾丸继代细胞,鸡胚接种部位出现明显的痘斑;牛睾丸细胞出现聚集、变圆等明显的细胞病变。利用1对绵羊痘病毒T4肽基因特异性引物进行了PCR扩增,获得与预期大小一致的约300 bp的片段。将所得序列与GenBank收录的绵羊痘病毒、山羊痘病毒等毒株相关序列进行比较分析。结果表明,该分离株与国外其他绵羊痘病毒株具有较高的同源性,达97.4%～99.3%;与山羊痘病毒株同源性为96.4%。通过试验初步证明所分离的病毒为绵羊痘病毒,并将该毒株命名为绵羊痘病毒DY株。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株编码复制酶聚蛋白 ORF1的克隆及结构特征分析

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株编码复制酶聚蛋白的ORF1序列,将其进行克隆、序列测定和分析。确认SC-Y株ORF1全长20 053 nt(GenBank收录号DQ390461)。该序列包含2个ORF,其中ORF1a由12 053个核苷酸构成,可编码由4 018个氨基酸组成的多肽,ORF1b由8 036个核苷酸构成,可编码由2 678个氨基酸组成的多肽。对SC-Y与TGEV参考毒株及不同冠状病毒对应区进行序列比较,结果显示,SC-Y株与PUR46-MAD株的同源性最高,ORF1a的核苷酸同源性为99.5%,推导氨基酸同源性为99.2%,ORF1b的核苷酸及推导氨基酸同源性均为99.8%;不同冠状病毒之间ORF1b比ORF1a具有更高的保守性。     

绵羊痘病毒P32基因克隆与进化分析

利用PCR技术扩增出羊痘病毒结构蛋白P32基因,并进行同源性比对及进化分析.结果表明,该病毒与其他绵羊痘病毒与山羊痘病毒同源性分别为99％与96％.     

绵羊痘病毒的分离与鉴定

利用羔羊睾丸细胞、Marc-145、Vero细胞对病毒进行分离和培养,通过动物回归试验、组织病理学切片的观察、透射电镜观察、PCR鉴定等方法进行病毒的鉴定,并参照GenBank中绵羊痘病毒P32基因序列设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的P32基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行同源性比对分析。结果显示:透射电镜下观察到典型的痘病毒粒子;动物回归试验中试验动物临床症状为典型的羊痘症状;组织病理学切片中观察到羊痘病毒嗜酸性包涵体;通过DNASTAR与参考毒株进行同源性比对,与参考株同源性为97.2%~99.5%。结果表明:该分离株为绵羊痘病毒,并命名为SPPV-NeiMengG2015。     

山羊痘病毒069蛋白的表达与结构分析

为了分析山羊痘病毒THx株069基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本试验应用PCR技术对069基因进行扩增,并构建原核表达载体,经测序鉴定后用IPTG诱导表达其蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。用DNAStar及Mega软件对GenBank登录的24个该基因参考序列进行同源性比对并作遗传进化树分析;同时采用生物信息学分析方法对069蛋白信号肽、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、抗原决定簇、亲水性、二级及三级空间结构进行预测。结果表明:GTPV-069号基因全长为573 bp,与参考株GTPV-pellor相似度高达97.19%,经同源性比对与遗传进化树分析发现,山羊痘病毒THx株069基因序列与绵羊痘亲缘关系较近,在同一分支上,与疙瘩皮肤病和其他山羊痘亲缘关系较远。SDS-PAGE鉴定表明069蛋白大量表达于上清中,条带清晰。Western blot结果证明069蛋白与His标签确实进行了融合表达;生物信息学分析发现GTPV-069蛋白无信号肽、含有跨膜结构,跨膜区在29～51 aa之间,为典型的膜蛋白。069蛋白含有8个抗原决定簇、1个糖基化位点和14个磷酸化位点。二级结构分析显示,069蛋白中α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占43.46%,25.65%,23.04%和7.85%,三级结构预测发现069蛋白以α螺旋为主。本试验为后期探究羊痘病毒其他部分生物学功能以及新型羊痘疫苗的研制提供了依据。     

绵羊痘病毒甘肃流行株糖蛋白基因ORF117的克隆及其原核表达

以甘肃景泰疑似羊痘(SP)患病绵羊的皮肤组织中提取的总DNA为模板,经PCR扩增获得SP病毒(SPV)ORF117基因.测序后分析表明,该基因由591个核苷酸组成,编码196个氨基酸;将该基因克隆于pET32 载体中,构建重组表达质粒pET-ORF117,用IPTG在不同条件下诱导表达,确定其最佳表达条件.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白分子质量为42 ku,主要以包涵体的形式存在.在IPTG浓度为0.1 mM、温度为37℃、诱导6 h时表达量最大,约占菌体蛋白的30%.Western blot试验表明,融合蛋白可被羊痘阳性血清识别,这为研究其在新型疫苗和诊断的研究奠定了基础.     

牛疙瘩皮肤病病毒ORF132基因的克隆及其原核表达

为原核表达牛疙瘩皮肤病病毒(LDSV) ORF132并对该基因进行生物信息学分析,本研究采用PCR扩增LSDV的ORF132基因,将其亚克隆至pGEX-6p-1载体中,构建重组质粒pGEX-LSDV-ORF132.生物信息学分析表明,LSDV的ORF132与Neethling vaccine LW1959株LW132、NI-2490株LSDV132和NW-LW株LD132的相应推导氨基酸同源性分别为100％、100％和94.4％,与山羊痘病毒、绵羊痘病毒相应推导氨基酸的同源性为20.7 ％～36％.SDS-PAGE和western blot分析表明,pGEX-LSDV-ORF 132在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导主要以包涵体形式存在,其重组蛋白大小约为48.95ku,并且与特异性抗体具有抗原反应活性.     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

青海细毛羊羊痘病毒的PCR诊断与病原分离鉴定

为对青海细毛羊临床疑似羊痘病毒感染病例进行确诊,并对病原进行分离与鉴定,将发病羊的皮肤痘疹和水疱等组织病料分别进行PCR检测和接种绵羊睾丸细胞,PCR检测结果为阳性,接种病料的绵羊睾丸细胞表现出了明显的、规律性的细胞病变,且分离毒株能被羊痘病毒阳性血清所中和,其P32基因核苷酸序列与Gen Bank上登录的绵羊痘病毒P32基因序列同源性达99.1%~100%。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。