SRAP在西藏木瓜属种质资源研究中的应用

利用正交设计,首次对西藏木瓜属植物SRAP-PCR反应体系中的引物浓度、Taq酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+在4个水平上进行优化,建立了木瓜属植物SRAP-PCR反应的最佳体系:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,引物浓度0.4μmol·L-1,Taq酶1.0U,dNTPs浓度0.3mmol·L-1,模板DNA70ng,Mg2+浓度2.0mmol·L-1。用引物组合M1E7和M3E18检验上述优化体系,结果显示该体系具有较高稳定性。在此基础上,用筛选的28对SRAP引物组合对21份西藏野生木瓜资源总DNA进行SRAP-PCR扩增,共检测出420个位点,其中多态性位点数363个,多态性位点百分率为86.67%。为此,SRAP分子标记可用于木瓜属植物遗传多样性的研究。     

安徽乌菜SRAP技术体系的优化

以合肥黄心乌为试材,利用正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度和模板DNA浓度进行5因素4水平的筛选分析,用me3-em3引物组合进行PCR扩增以确定最佳反应体系。结果表明,安徽乌菜SRAP-PCR最佳反应体系为:10×PCR buffer 1μL,Mg2+ 3.0mmol·L-1,dNTPs 0.2mmol·L-1,引物各0.5mol·L-1,模板DNA 4.0ng·μL-1,Taq聚合酶0.05U·μL-1,总体积为10μL。利用此反应体系对安徽乌菜进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定、可靠,可用于安徽乌菜的遗传分析。     

甜樱桃SSR体系的建立、优化及应用

为摸索适宜甜樱桃的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化,20μL反应体系中,Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度为1.5mmol/L、0.2mmol/L、0.4μmol/L,Taq酶宜加入1U,模板DNA应加入10～40ng;引物的最佳退火温度为56.0～62.8℃。用10对引物及建成的反应体系对10个供试品种扩增,6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,共有29个等位位点,证实该体系稳定可靠。     

草莓属植物SCoT分析体系的建立及优化

为利用SCoT技术开展草莓属(Fragaria)植物种质资源遗传多样性及分子系统学研究,以草莓属植物11个野生种和1个栽培品种为试材,采用L25(56)正交试验设计,建立了草莓属植物的最优SCoT-PCR反应体系,即20μL反应体系中,含Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 mmol·L-1、Taq酶0.75 U、引物0.75μmol·L-1、模板DNA 40 ng,并对退火温度进行了优化,对电泳检测方法及草莓属植物DNA提取方法进行了改进。共筛选出22个适于进行草莓属植物SCoT分析的引物。经验证,该反应体系稳定性好、可重复性强、多态性高、扩增效果好,适于草莓属植物的SCoT分析。     

西藏光核桃SRAP-PCR反应体系的优化和引物筛选

以西藏12份光核桃种质为试材,采用正交设计,从dNTPs、Mg²⁺、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶5种因素5个水平来优化SRAP-PCR反应体系,并对引物进行了筛选。结果表明:光核桃25μL的SRAP反应体系的最佳组分包括2.5μL 10×buffer,0.35 mmol/L dNTPs,1.5 mmol/L Mg²⁺,0.4μmol/L引物,20 ng模板DNA和2.5 U Taq DNA聚合酶。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以dNTPs浓度影响最大,模板DNA的影响最小。应用该体系从40个引物组合中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物组合23个。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为利用SRAP标记技术进行光核桃遗传多样性研究提供了依据。     

枇杷SSR反应体系的建立及优化

为探索适宜枇杷的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2＋、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化。结果表明：20uL反应体系中,Mg2＋、dNTPs和引物的最适浓度分别为1．5mmol．L-1、0．15mmol·L-1、0．2umol·L-1,Taq酶最适用量为1U,模板DNA最适用量为20ng;引物的最佳退火温度为51．0～60．0℃。利用该反应体系对17份枇杷种质进行扩增,电泳结果显示,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

枇杷属植物ISSR反应体系的建立和优化

首次通过正交实验,对影响枇杷属植物ISSR反应较大的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol·L-1,Taq酶1.5U,引物0.3μmol·L-1,模板DNA60ng,dNTPs0.15mmol·L-1。反应程序为94℃预变性5mim;94℃变性1mim,退火温度70s,72℃延伸1.5mim,40次循环;72℃延伸7mim,4℃保存。     

部分柿属植物SRAP-PCR反应体系的优化

SRAP技术是一种多态性和信息量丰富的新的分子标记技术,其技术简便、快速,不需预知序列信息,近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建以及比较基因组学研究等方面得到广泛应用。为了建立柿属植物SRAP技术体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、引物浓度等因素进行了优化。确定优化的反应体系为:模板DNA30ng,Buffer1×,Mg2+2.5mmol/mL,dNTPs0.2mmol/L,Taq酶1u,引物0.3μmol/L,反应总体积25μL。该体系在柿属植物6种1类型共29个基因型中获得较好的扩增结果,可望在柿属植物起源和进化研究中应用。     

黄绿蜜环菌SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

以CTAB法提取的黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens) DNA为模板,应用L16(45)正交实验设计,对Mg+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶、模板浓度5种因素进行SSR-PCR反应体系优化,建立了适合黄绿蜜环菌SSR-PCR反应的最佳体系并对退火温度进行检测.结果表明:在15μL反应体系中包括:1×PCR Buffer,100 ng模板DNA,dNTPs 217ìmol/L,引物0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.75 U,Mg2+ 1.3 mmol/L.稳定性检测证明,该反应体系具有较高的稳定性和重复性,并从34对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物8对.该体系的建立为今后利用SSR标记对黄绿蜜环菌遗传多样性研究、亲缘关系分析及种质资源鉴定等研究提供了依据.     

苹果IRAP技术体系的建立及优化

通过苹果逆转座子长末端重复序列(LTR)保守区域设计引物,对影响苹果IRAP反应的重要因素进行了研究,建立并优化了苹果IRAP分子标记技术体系。优化的苹果IRAP分子标记体系为:25μL反应体系中,模板DNA50ng、Mg2+2.5mmol·L-1、dNTPs0.2mmol·L-1、10×buffer2.5mmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0U、引物0.4μmol·L-1。该体系在所试苹果品种中均获得了较理想的扩增效果,并能鉴定部分芽变品种。     

正交设计优化果梅ISSR反应体系

以果梅(PrunusmumeSieb.etZucc.)品种鸳鸯梅为试材,采用改良的CTAB法提取果梅嫩叶DNA,利用正交设计L16(45)探讨Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对果梅ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了果梅的ISSR-PCR优化反应体系,在20μL反应体系中含2μL10×Buffer,2.5mmol·L-1Mg2+,0.2mmol·L-1dNTPs,0.32μmol·L-1引物,20~80ng模板DNA,0.75UTaqDNA聚合酶。在此基础上探讨了引物UBC840的最适退火温度、最佳循环次数及延伸时间,引物UBC840的最适退火温度为50.6℃。应用该优化反应体系,用2个不同引物对19份果梅资源DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化的反应体系具有较高的稳定性。     

利用正交设计优化番茄SRAP-PCR反应体系

以番茄耐低温材料抗寒0号和不耐低温番青的F2为材料,利用正交试验设计对SRAP-PCR反应体系中的5因素（模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶）在4个水平上进行正交优化试验。结果表明：各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为：引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+。建立番茄耐低温SRAP-PCR的20 μL最佳反应体系为：模板DNA为15 ng、引物浓度0.75 μmol?L-1、Mg2+浓度2.0 mmol?L-1、dNTPs浓度0.125 mmol?L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U。     

枇杷AS-PCR反应体系的建立和优化

【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系,为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’为试材,通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,引物0.5μmol·L-1,模板DNA80ng,dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94℃预变性1 min;94℃变性30 s,退火温度30 s,72℃延伸1 min,35次循环;72℃延伸5 min,4℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系,利用该体系成功确定了‘大五星’的S基因型为S2-S41,其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因,它们在GenBank上的登录号分别为JQ228451和JX217035。     

葡萄目标起始密码子多态性反应体系的优化

SCoT标记是一种新型目的基因分子标记方法,采用L16(45)正交试验和单因素试验2种方法优化了葡萄SCoT-PCR反应体系,结果表明正交试验中关键影响因子为dNTPs浓度,单因素试验中为dNTPs和Mg2+浓度.综合2种方法,优化的葡萄SCoT-PCR反应体系为:Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 ...     

利用正交设计优化甘蔗SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16（45）对甘蔗SRAP-PCR反应体系的五大因素（Mg2＋、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶）在4个水平上进行优化,得到如下结论：各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次是：Mg^2＋、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA;通过对各因素进行筛选,建立甘蔗SRAP-PCR反应的最佳体系（20μL）为：dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.1μmol/L、Mg^2＋2.5 mmol/L、Taq酶0.25U和模板DNA 60 ng。     

苹果SRAP-PCR反应体系的建立

以苹果(Malus domestica Borkh.)品种Telamon及Telamon×Fuji的F1代为试材,采用改良的CTAB法提取苹果叶片的DNA,利用正交设计L16(45)和直观分析以及方差分析相结合,探讨了Mg2+、dNTPs、Primer、Taq聚合酶、模板DNA用量对苹果SRAP-PCR反应的影响。建立了总体积为10μL的苹果SRAP-PCR反应体系,Mg2+浓度为2.0mmol.L-1,dNTPs浓度为0.8 mmol.L-1,Primer浓度为0.2μmol.L-1,Taq DNA聚合酶含量为0.6 U,DNA含量为60 ng,并含1μL 10×buffer(Mg2+free)。应用该反应体系,用不同的引物组合对48份苹果样品DNA进行SRAP-PCR扩增,结果显示反应体系具有较高的稳定性。