猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。     

猪伪狂犬病毒野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪伪狂犬病毒(PRV)野毒抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了猪伪狂犬病毒gE蛋白,以纯化的重组gE蛋白为包被抗原建立了检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRV基因组gE基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约606 bp的gE基因片段,将目的片段亚克隆至pET30a原核表达载体中,经IPTG诱导重组gE蛋白的表达,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.2%。本研究建立的gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。     

猪细小病毒VP2蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

参照已发表的PPV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约810 bp的VP2基因片段。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的VP2-ELISA诊断方法。该方法检测其他7种常见猪病病毒(PCV-2、PRV、PRRSV、JEV、PEDV、TGEV、CSFV)的阳性血清均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.3%、86.6%和94.5%。本研究制备的重组VP2蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV VP2-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为猪细小病毒病的快速诊断、免疫猪群抗体监测和流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

IBRV重组gD蛋白的真核表达与间接ELISA检测方法的建立

通过优化牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）gD基因序列为Sf9细胞偏好密码子,转座形成穿梭载体,将质粒瞬时转染Sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统表达纯化重组IBRV gD蛋白;以制备的重组IBRV gD蛋白为包被抗原,建立检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法,并通过比对检测已知血清中和抗体效价的牛血清,验证所建立的间接ELISA方法的敏感性、特异性与重复性等指标。结果显示：本研究建立的间接ELISA方法对相关的牛病毒血清抗体无交叉反应,敏感性可达1:512,组内和组间变异系数均低于10%;使用建立的间接ELISA检测方法结合血清中和试验,对480份临床血清样品进行检测,发现两者敏感性符合率为98.18%,特异性符合率为93.33%,总符合率为96.67%。结果表明,本研究建立的检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可开发为临床适应的检测试剂盒。     

基于截短表达的外膜蛋白P5的间接ELISA方法建立

为建立一种快速有效的检测副猪嗜血杆菌(HPS)抗体的方法,本研究选取之前研究中已验证具有良好抗原性和免疫原性的截短表达的重组外膜蛋白P5 (P5F3),将其纯化后作为包被抗原,建立了检测HPS抗体的间接ELISA诊断方法.该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为HPS的快速诊断、免疫猪群抗体监测和HPS流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

参照IBV S1基因序列,RT-PCR扩增长约867bp的S1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆到pET30α原核表达载体,转化Rossetta表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组S1蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的免疫活性。以该蛋白作为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)抗体的间接ELISA检测方法。该方法与其他6种常见禽病病毒(H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)、H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)、新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡法氏囊病毒(IBDV))阳性血清不发生交叉反应;批内和批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;相对于HI试验的符合率、敏感性、特异性分别为91.58%、91.24%和92.31%;相对于IDEXX ELISA的符合率、敏感性、特异性分别为94.55%、95.42%和92.96%;应用该方法检测山东及周边地区2 685份免疫鸡和168份未免疫鸡血清样品,免疫合格率和阳性感染率分别为85.25%和17.26%。本试验截短表达的S1蛋白具有良好的免疫活性,建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性,将为IBV的免疫抗体监测、临床野毒感染快速诊断和流行病学调查提供了一种新的血清学诊断技术,具有良好的推广应用前景。     

IBRV gD蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

利用生物学软件分析牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白的抗原决定簇,发现相应的核酸序列,设计特异性引物用PCR扩增IBRV gD基因片段并克隆到原核表达载体pET-32a中,通过双酶切鉴定正确和测序正确后进行诱导表达。利用间接ELISA方法和Western blot鉴定gD重组蛋白的免疫原性和反应原性。最后将gD重组蛋白用作包被抗原,并通过优化相应的反应条件建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的gD重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,间接ELISA阴阳性临界值为:D_(450 nm)值=0.23。重组抗原gD与口蹄疫、牛病毒性腹泻、赤羽病、副结核病、布鲁菌病、结核病等阳性血清无交叉反应,具有比较好的特异性。组内和组间变异系数均小于5%,重复性较好。建立的ELISA方法结果显示,当测试相同的200个临床血清样本时,与IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒gB X3抗体检测试剂盒相比,两者符合率为96%。本试验为IBRV抗体间接ELISA检测试剂盒的开发奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

以原核表达的猪伪狂犬病毒gE蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法并进行相应优化,研制出了猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,并与国内市场标杆产品进行比较,发现阳性符合率为88.03%,阴性符合率为91.47%,总体符合率达到89.84%。同时,该试剂盒批间、批内变异系数均小于10%,具有较好的重复性。该检测试剂盒的研制,可为猪场猪伪狂犬病毒野毒感染的检测提供技术支撑。     

基于重组截短RHDV VP60蛋白的间接ELISA抗体检测方法

为了建立一种快速、特异、敏感的RHDV抗体检测方法,对VP60蛋白基因的抗原表位区域进行分析,截取VP60-1、VP60-2、VP60-3、VP60-semi1和VP60-semi2,大肠杆菌表达后纯化获得重组截短蛋白.经抗原、抗体结合反应比较,以VP60-semi1为包被抗原检测效果最好,并建立了基于重组蛋白VP60...     

新城疫病毒HN基因的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种快速的新城疫病毒(NDV)抗体检测方法,参照已发表的NDV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1044bp的HN基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92.0%、91.0%和93.6%。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因截短表达及其抗血清制备

gD糖蛋白是IBRV感染细胞的主要分子,在病毒吸附和侵入宿主细胞中发挥着重要作用。利用IBRV基因组DNA为模板,经生物学软件DNAstar分析主要抗原区,PCR扩增gD基因786bp片段,定向连接到pET32a(+)表达载体中,筛选阳性克隆转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达部分可溶的重组蛋白。Ni-NTA非变性纯化系统纯化蛋白,纯化的蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,利用间接ELISA法检测抗血清效价为1∶6400;同时以该血清进行血清中和病毒实验,中和指数为1∶640,显示该抗血清具有良好的抗病毒能力,为进一步开发牛传染性鼻气管炎(IBR)的诊断检测试剂和疫苗奠定了重要基础。     

狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞中的表达

将狂犬病病毒糖蛋白（ＲＶｇｐ）基因ＢｇｌⅡ片段（１６７５ｂｐ）分别正向插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－１７ｂ和ｐＥＴ－１７ｂ２（用ＳａｃⅠ－ＮｄｅⅠ缺失掉ｐＥＴ－１７ｂ６０ｂｐ含起始密码子ＡＴＧ小片段）的ＢａｍＨⅠ切点，构建重组质粒ｐＥＴ－１７ｂＲＶｇｐ和ｐＥＴ－１７ｂ２ＲＶｇｐ。将其分别转化表达受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）和Ｅ，ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ．ＩＰＴＧ诱导表达，菌体经超声波裂解处理后ＳＤＳ－ｐＡＧＥ，染色，在分子量约６００００处可见重组质粒表达的较宽的蛋白带，以抗ＲＶｇｐＭｃＡｂ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，表明该表达蛋白为ＲＶｇｐ。通过扫描显示，表达的ＲＶｇｐ占菌体总蛋白的１０％～１４％，其中ｐＥＴ－１７ｂ２ＲＶｇｐ在Ｅ。ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中的表达量最高。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白主要抗原区域的高效表达、纯化与鉴定

参照IBRV基因组序列,设计合成1对特异性引物,扩增了长约846 bp的gD基因片段。将目的片段定向克隆到pET-30a原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。本研究利用原核表达系统成功表达具有良好抗原性的gD蛋白,为IBRV的深入研究及诊断试剂的研制奠定了物质基础。     

猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gD主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本试验通过PCR方法以猪伪狂犬病病毒SD株的基因组DNA为模板扩增得到了含gD主要抗原表位编码区的片段,将该PCR产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游。构建的重组质粒pET-gD经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量约为45.2 ku,主要以包涵体形式存在。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该纯化蛋白能与猪伪狂犬病病毒抗体阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原反应性,可以作为猪血清伪狂犬病病毒抗体诊断用抗原。     

猪乙型脑炎病毒E蛋白的原核表达与鉴定

参照已发表的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增长约972 bp的E基因片段。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

经DNAstar分析，据牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）全基因序列设计合成gB基因的特异性引物，以构建的pGM-T-gB为模板，PCR扩增IBRVgB蛋白192-266位氨基酸的基因序列。将目的片段克隆，酶切鉴定并测序鉴定后，定向插入pET32a表达载体中，转化表达菌BL21。SDS-PAGE电泳分析表明，诱导表达产物以包涵体和可溶形式存在，大小约为29．2ku，与预测值相符。亲和纯化后重组蛋白浓度为2．000mg／mL，纯度为79．2％。间接ELISA检测证明，表达蛋白具有抗原性。以该蛋白作为诊断抗原，建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为50／zg／mL，血清的最佳稀释度为1：40，阳性标准定为s／e〉0．395。交叉试验表明对牛流热（BEV）、牛肺疫（CBPP）、牛病毒性腹泻（BVD）、牛结核（BTB）、牛副结核（PBB）以及牛赤羽病（BAD）等其它6种疾病阳性血清不发生交叉反应。与中和试验相比较，特异性、敏感性和符合率分别为83．3％、90．9％和88．9％；与进口法国IBRV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较，特异性、敏感性和符合率分别为92％、92．7％和92．5％。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性，显示了良好的应用前景。     

猪流行腹泻病毒N蛋白表达与PPA-ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪流行性腹泻病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因序列,RT-PCR扩增了长约1 300 bp的N基因片段,连接pET30a表达载体后获得了以可溶性形式表达的重组N蛋白.重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性.以该蛋白作为诊断抗原,建立检测PEDV抗体的PPA-ELISA诊断方法.该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为PEDV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和PEDV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的截短表达与活性检测

本研究参照已发表的PCV2基因组序列,设计合成1对特异性引物,以PCV2基因组DNA为模板,PCR扩增了长约480 bp的ORF2基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用亲和层析法在变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.396 mg/mL。纯化蛋白经免疫印迹、间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。     

兔病毒性出血症病毒重组蛋白VP60间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种快速的兔病毒性出血症病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组VP60蛋白作为诊断抗原,建立了检测兔病毒性出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法检测3种常见兔病(兔轮状病毒、仙台病毒和魏氏梭菌)的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于4.9%和6.9%。本研究建立的RHDV VP60-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为RHDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供了一种技术手段。