ASIP蛋白与AgRP相关蛋白生物信息比较分析

利用生物信息学的方法研究人、绵羊和牛等18个物种Agouti信号蛋白(ASIP)和Agouti相关蛋白(AgRP)的编码区及其对应氨基酸序列的相关特征,以期探明两种蛋白的遗传分化特点。结果表明,在ASIP与AgRP均为399bp的CDS序列中,其核苷酸保守区域的位置分别在262~399bp和230~399bp处;ASIP和AgRP在各自CDS序列多态位点变异的各项指标数值及其百分率大小上均极为接近;在46条ASIP的CDS序列及32条AgRP的CDS序列中,二者的单倍型数分别为22种和23种,ASIP和AgRP在基因的进化以及不同物种的遗传分化上具有相似性;两者的氨基酸序列在98~140aa片段处保守性较高,该区域同时富含半胱氨酸(Cys);ASIP和AgRP一级结构的理化性质表现为共性与差异并存;二者的肽链C端具有相似的三维结构,但各自也具有其结构特异性。     

不同毛色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织中黑色素分布及ASIP蛋白的表达定位

为了研究ASIP基因在中国美利奴细毛羊被毛颜色形成过程中的作用机制，试验分别选取体况良好的3只野生型纯白色中国美利奴细毛羊，20只纯白色、8只棕色和10只黑色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊背部的皮肤组织，通过H.E.染色对比样本皮肤组织结构及黑色素分布差异；采用免疫组织化学染色检测ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊白色、棕色、黑色3种皮肤组织中ASIP蛋白的表达定位情况。结果表明：野生型与ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的皮肤均由表皮、真皮、皮下结缔组织3部分组成，且表皮层最薄，各毛色皮肤结构组成无差异；黑色素颗粒主要分布于黑色、棕色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织的毛囊、毛干中，且黑色较棕色皮肤组织中分布的黑色素颗粒更为密集，而在白色被毛的野生型和ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织中均未发现黑色素颗粒；ASIP蛋白在白色被毛的ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的表皮、毛囊外根鞘、毛乳头周围的毛基质中大量存在，在棕色、黑色皮肤组织中几乎不存在。说明ASIP蛋白在特定部位的表达情况与ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的白色被毛毛色的发生相关。     

ASIP基因第3外显子349位点多态性与中国家驴毛色表型相关研究

本研究以16个品种680头中国家驴为实验群体,通过PCR-RFLP方法检测ASIP基因第3外显子349位点的多态性,并分析其多态性与中国家驴毛色的关联性。结果表明:中国家驴ASIP基因第3外显子存在c.349T>C突变,纯黑色的驴基因型以CC型为主,德州驴、渤海驴、广灵驴和庆阳驴中的纯黑色驴全是CC型;非纯黑色驴主要是TT和CT基因型,没有检测到CC基因型。利用ASIP基因第3外显子PCR-RFLP标记可以把家驴中纯黑色和非纯黑色驴分开,作为家驴中纯黑色驴早期选种的分子标记。     

鸡刺鼠相关蛋白多肽抗体的制备与鉴定

制备鸡刺鼠相关蛋白(agouti-related protein,AgRP)多肽抗体并鉴定。根据GenBank中报道的AgRP一级结构信息,用TMHMM 2.0和DNA Star软件分析其蛋白跨膜结构域、二级结构、疏水性、亲水性等,设计出1段13个氨基酸的多肽。将合成后的多肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联,用与BSA偶联的AgRP多肽免疫新西兰大白兔,获取血清后亲和纯化出抗AgRP多肽抗体。通过ELISA法检测效价,Western blot和免疫组化法检测抗体特异性。结果获得了高效价的鸡AgRP多肽抗体,ELISA法测定其效价可达到1∶128 000,并可用于免疫组化研究。     

野猪ASIP基因的突变位点及其与毛色表型的相关性研究

 本试验旨在研究影响动物被毛颜色变化的功能基因ASIP在野猪群体里的变异及其与被毛表型之间的相关性。通过直接测序法搜寻ASIP基因编码区、5′ UTR、3′ UTR和部分内含子区域突变位点。结果表明：在ASIP基因的3′ UTR区域识别了一个T→C突变位点（ASIP.c 695 T→C）,而在其它区域没用发现。通过群体内多态性检测,7个毛色类型的野猪在此突变位点都是CC或CT基因型,而长白猪群全部是TT基因型。从这个结果得出具有不同毛色的野猪群体可能是由突变位点C等位基因引起,不能排除还有其它毛色功能基因参与野猪被毛的形成。研究为进一步了解野猪ASIP毛色功能基因在其群体内的遗传变异奠定了理论基础。     

水貂ASIP基因单倍型检测及其皮肤组织mRNA差异表达分析

试验旨在探究鼠灰色（agouti signaling protein,ASIP）基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）形成的单倍型及皮肤组织差异表达mRNA对水貂被毛色素沉积的影响。通过PCR扩增、Sanger测序技术对金州黑水貂、红眼白水貂和名威银蓝水貂ASIP基因进行SNPs单倍型检测分析,利用实时荧光定量PCR技术检测3种毛色皮肤组织ASIP基因的表达量,分析单倍型及mRNA差异表达与毛色表型的相关性。结果表明,301个样本中共检测到10个SNPs,内含子2中4个SNPs （G18A、A159G、G235T、C1189T）共形成10种单倍型（Hap1~Hap10）,其中Hap1（GAGC）和Hap2（GAGT）是3种不同毛色水貂群体的共享单倍型;部分内含子3中6个SNPs （C252T、A290C、G298C、A340G、T343C、T379C）形成4种单倍型（Hap1~Hap4）,且Hap2（CCCGCC）是名威银蓝水貂群体的主体单倍型。5个位点（A290C、G298C、A340G、T343C、T379C）均处于完全连锁不平衡状态。实时荧光定量PCR检测显示,金州黑水貂和名威银蓝水貂ASIP基因mRNA表达量分别是红眼白水貂的1.25和0.95倍,三者间差异不显著（P>0.05）。研究结果初步提示,ASIP基因调控水貂不同毛色表型形成的分子机制可能存在差异。     

家兔MC4R和ASIP基因的多态性筛选及生物信息学分析

以比利时公兔分别与加利福尼亚母兔、新西兰母兔和中国白母兔杂交兔为试验对象,用磁珠法动物基因组抽提试剂盒(血液)提取DNA并构建三组杂交兔的DNA池,采用双向测序技术对兔MC4R和ASIP基因SNPs进行筛选,结果在MC4R基因中发现了5个多态性位点:exon1-T33G、exon1-C52T、exon1-A101G、exon1-C105T、exon1-A492G,在ASIP基因中发现了2个多态位点:exon2-A185G和intron2-G64A。其中exon1-T33G、exon1-C105T、exon1-A492G为同义突变,intron2-G64A在内含子上,exon1-C52T、exon1-A101G和exon2-A185G为错义突变,分别使编码氨基酸由精氨酸(Arg)变为苏氨酸(Thr),天冬氨酸(Asp)变为甘氨酸(Gly)和组氨酸(His)变为精氨酸(Arg)。通过生物信息学对兔MC4R和ASIP基因突变前后RNA二级结构、蛋白质的二级结构和蛋白质的三级结构进行预测,其结果都有差异。     

蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的生物信息分析

文章旨在探究蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的生物学功能,利用在线生物信息学软件对蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的特性进行分析。结果显示,蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1由25氨基酸组成,为阳离子型多肽,二级结构中主要包含α-螺旋和少量β结构及无规则卷曲,理论等电点为9.99,净电荷为+2,具有较好的稳定性,呈疏水性,为细胞内表达,具有3个磷酸化位点。研究表明,对蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的预测分析可为天然抗菌肽改造以获得稳定安全的抗生素替代品提供信息学基础。     

贵州白水牛ASIP、MC1R和TYR基因多态及其与白毛性状的关联分析

ASIP、MC1R和TYR是与动物毛色性状相关的重要候选基因,为了探究ASIP、MC1R、TYR基因多态性及其与贵州白水牛白色被毛之间的关系。本研究以贵州白水牛（20头）和其他毛色水牛（60头）为试验材料,针对3个基因的外显子和部分非编码序列设计引物,利用DNA池作为模板进行扩增测序,对ASIP、MC1R和TYR基因多态性与贵州白水牛被毛之间的关系做了初步探讨。结果发现,在这3个基因中均没有发现特异性的插入/缺失突变,在贵州白水牛ASIP基因的启动子中发现了突变位点：Promoter-A147T和Promoter-A235G;在MC1R基因中筛选到1个错义突变exon1-T843C,TYR基因中筛选出2个错义突变exon1-G826A、exon5-T70C,以及1个同义突变exon3-A83G。这3个基因的SNP位点在扩大样本验证时发现不具有毛色特异性,研究初步表明,ASIP、MC1R、TYR基因的多态性位点不能解释贵州白水牛毛色的特殊变异,为以后对贵州白水牛的毛色的进一步研究奠定了基础。     

不同物种NF-κB1基因编码区生物信息分析

为了解不同物种NF-κB1基因编码区（CDS）的遗传变异,本试验使用生物信息学的方法比较分析了小家鼠、褐家鼠、人、黑猩猩、狨、毛猩猩、猕猴、家马、大熊猫、野猪、家短尾负鼠、牛、狼、非洲象和白颊长臂猿NF-κB1基因编码区的遗传多样性,并对该基因的氨基酸序列、跨膜结构域、导肽、信号肽和结构域进行了预测和分析,对有关NF-κB1基因功能的一些研究热点进行了回顾。结果表明：在15个物种36条基因序列中共检测到968个多态位点,生成24种单倍型,NF-κB1基因序列编码区在物种间存在丰富的遗传多样性;理论等电点均低于5.5,NF-κB1编码的蛋白呈酸性,N端无信号肽、导肽,无跨膜结构域,肽链表现为亲水性;这些蛋白均含有1个Rel同源域,6～7个Ankyrin重复,在结构上保守。     

不同物种Agouti基因编码区生物信息学分析

为了研究不同物种Agouti基因的遗传多样性,试验采用生物信息学方法比较分析了山羊、绵羊、牛、髯羊、野猪、马、犬、狒狒、黑猩猩、人、兔、家猫、鼠和猕猴Agouti基因编码区(CDS)的遗传多样性。结果表明:来自14个物种的77条基因序列中检测到93个多态位点,共生成30种单倍型,物种间及物种内Agouti基因序列编码区存在较丰富的遗传多样性。     

猪硬脂酰辅酶A去饱和酶蛋白生物信息学分析

为了探究硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的结构和生物学功能,利用Expasy、Sopma等生物信息学软件,对猪SCD的氨基酸序列进行初步的生物信息学分析。结果表明:猪SCD基因编码359个氨基酸,平均分子质量为41.38 ku;该蛋白存在4个跨膜结构域,分别包含1个潜在的O-糖基化位点、3个N-糖基化位点和16个磷酸化位点;二级结构由α螺旋、β转角、延伸链和随机卷曲组成;该蛋白具有低复杂结构和跨膜结构两种功能结构域。     

布鲁氏菌分泌蛋白BspD多克隆抗体制备及其生物信息学分析

本研究旨在获得布鲁氏菌BspD蛋白,制备其多克隆抗体,并分析其潜在生物学功能。根据流产布鲁氏菌（Brucella abortus）2308的BspD基因序列（GenBank登录号：NC_007618.1）获得BspD基因序列,对布鲁氏菌BspD氨基酸序列进行生物信息学分析,然后将目的基因嵌入pMD19-T载体,使用限制性内切酶切下目的基因重组入pET-28a（+）载体,构建pET28a-BspD重组载体,经过双酶切、测序验证后,IPTG诱导表达菌株,SDS-PAGE法鉴定BspD的表达,His标签蛋白纯化柱纯化BspD蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度。用纯化BspD蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体的效价及反应原性。结果表明,成功表达出37 ku BspD蛋白,BCA方法测得纯化BspD浓度为2 000 μg/mL;Western blotting结果显示制备的抗体具有良好的特异性,间接ELISA检测出BspD多克隆抗体的效价为1：12 800,成功制备出BspD多克隆抗体,但其反应原性较低。生物学信息分析得出BspD蛋白具有亲水性,存在跨膜区,无信号肽,有17个磷酸化位点和11个抗原决定簇,BspD蛋白二级结构以α-螺旋为主,达到86.80%,还存在少量延伸链、无规则卷曲、β-折叠等;在线软件Phyre 2构建BspD三级结构证实其多为α-螺旋。以上结果可为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白BspD的功能及分子机制提供参考。     

猴源葡萄糖调节蛋白78生物信息学分析及其真核表达

试验旨在探究葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78,GRP78）基因的理化性质和结构特点,阐述GRP78在猪流行性腹泻病毒复制中的分子伴侣作用和调控机制。通过RT-PCR方法扩增GRP78基因,并插入到pMD20-T Simple载体进行克隆测序,利用生物信息学方法对其氨基酸序列、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、三级结构等进行预测和分析。将GRP78基因插入pCDNA 3.1中,然后转染Vero-E6细胞。Western blotting检测Vero-E6细胞中GRP78的表达。生物信息学分析结果表明,GRP78基因全长1 965 bp,编码654个氨基酸,蛋白质分子质量为72.33 ku,理论等电点为5.07,分子式为C₃₁₈₉H₅₁₅₃N₈₆₅O₁₀₁₉S₁₃。遗传进化树分析显示,猴源GRP78基因与双峰驼、犬、猫、大猩猩、蝙蝠、狒狒、猪、马的氨基酸序列同源性为99.5%~99.8%;遗传进化分析显示,大猩猩和狒狒亲缘关系最为接近。跨膜区和信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽但不存在跨膜结构。GRP78蛋白无N-糖基化修饰位点,存在6个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,表明GRP78可能有与激酶磷酸化有关的PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,可能参与己糖代谢和单糖代谢。     

猪嵴病毒非结构蛋白2C的生物信息学分析

本研究运用RT-PCR方法从猪嵴病毒感染阳性样品中扩增出其非结构蛋白2C全基因,并将其克隆到T载体后进行序列测定。研究结果表明,猪嵴病毒非结构蛋白2C全长为1005 bp,编码335个氨基酸。所编的非结构蛋白2C大小为36.9297 ku,理论等电点为7.18;不稳定系数为39.41,属于稳定蛋白质类;脂肪族氨基酸指数为87.10,平均亲水性为-0.242。与其核苷酸同源性最高的是CH/HZ/2011株(GenBank登录号:JX827598),同源性为91.6%;同源性最低的是XX株(GenBank登录号:KC204684),同源性为88.8%。遗传进化分析结果显示,猪嵴病毒非结构蛋白2C在遗传进化树呈3个明显的结构分支,猪源嵴病毒匈牙利株和泰国株处于第Ⅲ遗传进化分支,猪嵴病毒中国分离株分处于第Ⅰ和第Ⅱ遗传进化分支,呈一定的区域流行性。     

肠炎沙门菌avrA蛋白的原核表达及其生物信息学分析

【目的】 表达具有生物学活性的肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis） avrA蛋白,并对其进行生物信息学分析,为研究肠炎沙门菌avrA蛋白对猪肠道细胞免疫功能的影响提供参考。【方法】 根据GenBank中肠炎沙门菌avrA蛋白全基因序列（基因ID：1254388）设计引物扩增avrA基因,回收的目的片段与表达载体pGEX-4T-1进行重组、克隆,用限制性内切酶和基因测序验证重组表达质粒的正确性。将验证后的重组表达质粒转化大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞,并在不同条件下对重组表达菌进行诱导表达。应用SDS-PAGE和Western blotting检测avrA蛋白的表达情况。将酶切测序后目的基因序列进行BLAST比对分析,并用ExPASy-Translate Tool软件预测avrA蛋白的氨基酸组成。应用生物信息学软件预测avrA蛋白的跨膜结构域、二级结构、三级结构及抗原性。【结果】 肠炎沙门菌avrA基因CDS序列全长为909 bp,编码302个氨基酸。限制性内切酶及基因测序分析结果表明,重组表达质粒pGEX-4T-1-avrA构建成功。SDS-PAGE和Western-blotting结果表明,重组菌所表达的avrA蛋白为可溶性蛋白。重组菌在15 ℃诱导16 h表达的蛋白量为10 mg/L,蛋白溶解度为40%。生物信息学分析表明,avrA蛋白为膜外蛋白,该蛋白的16―301位氨基酸具有来自超家族YopJ丝氨酸/苏氨酸乙酰转移酶的保守结构域;avrA蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链分别占43.71%、39.40%和16.89%;avrA蛋白三级结构预测结果与二级结构一致;avrA蛋白有9个与B细胞结合的抗原表位,分别在第5―40、51―68、80―92、94、101―109、146―157、160―168、199―231和236―298位氨基酸处。【结论】 试验成功克隆出肠炎沙门菌avrA基因,并成功构建重组表达质粒和表达菌,诱导表达的avrA蛋白为可溶性表达;avrA蛋白为膜外蛋白,有9个能与B细胞结合的抗原表位。本研究结果为进一步制备检测肠炎沙门菌感染的抗体提供参考。     

小鼠NIS蛋白的生物信息学特征及其在乳腺中的表达分析

为探究小鼠钠碘转运体（Na⁺/I^- symporter,NIS）蛋白的结构、功能及其在乳腺组织的表达特征,本研究扩增小鼠乳腺NIS基因编码区,测序鉴定后采用结构预测软件对NIS蛋白进行生物信息学分析,同时采用Western blotting、免疫组织化学技术和半定量PCR技术对NIS基因在不同乳腺发育时期的转录和表达水平进行分析。结果显示,小鼠NIS基因编码区全长1 857 bp,与人NIS的同源性为80.40%,保守性较强。NIS蛋白含有618个氨基酸残基,分子质量约为65.7 ku,分子式为C₂₉₉₆H₄₇₀₁N₇₄₉O₈₃₃S₃₂,理论等电点为7.44,半衰期为30 h,消光系数为102 510,不稳定系数为29.31,脂溶系数为105.91,富含疏水性氨基酸,为稳定的疏水蛋白。NIS蛋白二级结构含有α-螺旋（41.42%）、延伸链（18.28%）、β-转角（4.05%）和无规则卷曲（36.25%）,三级结构与之相一致。Western blotting结果显示,4个时期均出现特异性杂交带,大小为65.7 ku,与预期结果相符。免疫组织化学结果表明,NIS蛋白在小鼠的青春期、妊娠期到泌乳期的乳腺组织中表达量逐渐增加,在泌乳期达到高峰,存在显著差异（P<0.05）,在退化期逐渐恢复到类似青春期状态;NIS基因mRNA的变化规律与蛋白表达一致。本研究结果为进一步探究NIS蛋白在乳腺发育和泌乳调控中的作用提供了参考依据。     

Bioinformatics Analysis of the Structure and Function of BMPR-IB Gene Coding Protein in Goat

This study was aimed to analyze the structure and function of BMPR-IB gene coding protein by bioinformatics. The primary structure, secondary structure, subcellular localization, tertiary structure, important functional motifs and functional classification of BMPR-IB gene coding protein in goat were predicted and analyzed by online softwares. Phylogenetic tree of BMPR-IB gene coding proteins of different species were constructed by maximum likelihood method and phylogenetic analysis was performed.The results showed that the goat BMPR-IB gene encoded 502 amino acids, its coding protein belonged to an unstable hydrophilic protein. Secondary structure was mainly beta-sheet (63.5%). The protein was mainly located in the nucleus, and also distributed in mitochondria, cytoplasm, vesicle secretion system and plasma membrane. The proteins mainly played the roles of purine and pyrimidine, regulation, transport and binding, signal transduction and so on. There were one transmembrane domains in the location of 127th to 149th amino acids, the GS domain in the location of 174th to 203th amino acids and the protein kinase domain in the location of 204th to 494th amino acids were highly conserved motifs. The tertiary structure consisted of sheet fragment structure enrichment domain and helix helical structure enrichment domain. The results of phylogenetic analysis of BMPR-IB gene in different species was consistent with the results of animal taxonomy, and suggested that BMPR-IB gene was associated with the fertility traits. The structure and function of BMPR-IB gene coding protein in goat were analyzed by different online prediction software, which provided theoretical guidance for further study ofBMPR-IB gene.     

山羊BMPR-IB基因编码蛋白结构及功能的生物信息学分析

试验旨在利用生物信息学方法分析山羊骨形态发生蛋白受体IB（bone morphogenetic protein receptor IB,BMPR-IB）基因编码蛋白的结构及功能。本研究通过在线软件预测和分析山羊BMPR-IB基因编码蛋白的一级结构、二级结构、亚细胞定位、三级结构、重要的功能基序及其分类,通过最大似然法对不同物种BMPR-IB基因编码蛋白序列构建系统发育树,进行系统发育分析。结果发现,山羊BMPR-IB基因共编码502个氨基酸,其编码蛋白属于不稳定的亲水性蛋白质。二级结构以β折叠为主,比例为63.5%,主要存在于细胞核中,在线粒体、细胞质、囊泡分泌系统和质膜中也有少量分布。该蛋白主要发挥嘌呤和嘧啶、监管、运输和结合、信号转导等功能。在127-149氨基酸位置存在1个跨膜结构域;在174-203、204-494氨基酸位置存在2个高度保守的基序,分别为GS结构域和蛋白激酶结构域。三级结构由sheet片段结构富集域和helix螺旋结构富集域组成。不同物种BMPR-IB基因系统发育分析结果与动物学分类结果一致,提示BMPR-IB基因与繁殖力性状存在联系。通过不同的在线预测软件分析了山羊BMPR-IB基因编码蛋白的结构及功能,为深入研究BMPR-IB基因提供理论指导。     

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3C的原核表达及生物信息学分析

为获得猪脑心肌炎病毒（EMCV）3C蛋白并进一步了解其结构,本研究以EMCV HB10株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增3C基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定,挑选测序正确的质粒经双酶切获得目的片段并将其克隆至pET32a载体以构建重组原核表达质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌TranSetta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况,Western blotting检测纯化后3C蛋白及其对EMCV的反应原性。结果显示,成功克隆3C基因,长度为615 bp,编码205个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,3C蛋白主要以包涵体形式表达,His-3C蛋白大小约为40 ku。Western blotting分析可知,纯化后His-3C蛋白条带单一,同时3C蛋白与EMCV细胞毒有良好的反应原性。经生物分析软件预测可知,EMCV 3C蛋白为非分泌蛋白,无跨膜区,有多个磷酸化位点,参与蛋白的水解过程。3C蛋白酶作为EMCV基因组编码蛋白中唯一的蛋白酶,在病毒复制的过程中具有不可或缺的作用。本研究成功构建了EMCV 3C蛋白原核表达载体并对其结构进行了预测,为进一步研究3C蛋白的作用及催化机理奠定基础。