基因打靶技术在动物生产中的应用

<正>基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的一项分子生物学技术,它利用基因转移的方法,将外源DNA序列导入靶细胞,通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组,将外源DNA定点载入靶细胞基因组上某一特定的位点,或     

锌指核酸酶技术研究进展

重组锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)是锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白,可切割特异DNA序列,引起DNA双链断裂(double strand break,DSB),提高了依赖同源重组完成特定基因改造和修饰等的基因打靶的效率,为转基因及基因治疗研究提供了更有效的技术...     

基因打靶技术的研究进展

基因打靶技术是通过外源基因与受体细胞染色体基因组上的序列之间发生同源重组,将外源基因整合到某一特定位点上,从而实现外源基因的定点整合、修饰和改造受体细胞遗传特性的技术。作者简要介绍基因打靶技术的基本原理、产生、筛选策略及该技术的应用等研究进展。     

基因打靶技术及其应用

基因打靶技术是通过将外源DNA的同源序列和活细胞内的染色体DNA发生同源重组,达到定点修饰染色体上某一特定基因的一种分子生物学技术。它与克隆技术的结合发展为畜牧生产中的动物育种工作开辟了广阔的前景,为人类带来更多、更好的食物和药物,人类健康将获得更好的保障。     

基因打靶技术及其应用

基因打靶技术是通过将外源DNA的同源序列和活细胞内的染色体DNA发生同源重组，达到定点修饰染色体上某一特定基因的一种分子生物学技术。它与克隆技术的结合发展为畜牧生产中的动物育种工作开辟了广阔的前景，为人类带来更多、更好的食物和药物，人类健康将获得更好的保障。     

基因打靶用于哺乳动物体细胞核移植技术研究进展

哺乳动物体细胞核移植技术以其供核效率高而在动物克隆技术中占有明显的优势；基因打靶技术通过外源DNA与染色体DNA间的重组可达到定点修饰，改造基因组的目的，它与体细胞核移植技术相结合具有巨大的技术优势和广阔的应用前景。将为畜牧生产和医学生物学的研究带来前所未有的价值。     

基因组编辑技术的研究进展

随着人类测序技术的发展与成熟,以锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因(CRISPR/Cas)为主的基因组编辑技术,在生物、农业、环境及医学等各个领域中发挥着独特的作用。基因编辑技术主要是通过在外源DNA靶位点上产生双链切口,从而诱导出同源重组修复或非同源末端连接,进而实现基因组的编辑。目前ZFN和TALEN技术被广泛运用,虽然在一定程度上获得明显的效果,但因设计复杂,成本较高,使其运用有所局限。CRISPR/Cas技术近年来凭借其高效、精确的编辑成为最新一代的基因编辑技术。本文就以上3种基因打靶技术的作用原理、应用及优缺点作简单概述,为基因编辑的实践应用提供理论基础。     

基因打靶技术的研究概况

基因打靶是通过外源DNA与染色体DNA同源序列之间的重组来改造基因组特定位点,从而改变生物遗传特性的方法。它可以纠正染色体特定位点上的自发突变,恢复细胞正常的生理功能;也可以把理想突变引入到基因组的某一位点,使之稳定地遗传下去。本文从基因打靶的基本原理、打靶载体、打靶策略、筛选策略、条件性打靶及其实际应用等方面做了详细的综述。     

动物基因打靶技术的原理与应用

基因打靶是利用同源重组的原理 ,定点修饰目的基因组上特定位点的基因 ,定向地改变生物遗传特性的方法 ,作为新兴的遗传工具 ,它有着广泛的应用前景。     

家畜基因打靶研究进展

将一段DNA片段导入哺乳动物细胞中后，能够定位并且与内源的同源序列重组，这种类型的同源重组叫做基因打靶(gene targting)。基因打靶技术可以用来生产转基因动物。在小鼠胚胎干细胞中应用这一技术已生产出各种不同基因位点的突变体，可对小鼠中特异性基因的表型进行评价。基因打靶技术不只是一种使基因失活的手段，而且可作为一种用来改变基因活性的方法。     

利用CRISPR/Cas9系统构建绿色荧光转基因斑马鱼

斑马鱼是研究人类疾病的重要动物模型,基因组定点编辑技术在利用斑马鱼研究同源基因功能方面提供了简便高效的途径。利用CRISPR/Cas9系统,在斑马鱼TU品系第5号染色体中选择靶位点,将Cas9 mRNA、靶位点识别的sgRNA和带有同源重组臂、利用短链肌球蛋白(Mylz2)启动子启动的绿色荧光蛋白(eGFP)基因显微注射到斑马鱼受精卵中,获得在该位点定点插入外源基因,并在肌肉中特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼。利用基因组DNA的PCR扩增,结合激发光下斑马鱼胚胎荧光表达情况,在存活的87尾幼鱼中发现其中45尾有荧光表达,同源重组率为51.724%。研究表明,利用CRISPR/Cas9系统成功定点插入外源基因,并获得在肌肉中特异性表达绿色荧光的斑马鱼。     

利用锌指核酸酶对猪基因组进行定向遗传修饰

人工锌指核酸（zinc finger nucleases,ZFN）在植物和动物细胞中可以有效提高DNA修饰的效率和特异性使它很快就成为当前的一个研究热点。ZFN可使DNA双链断裂,然后依靠细胞中复杂的DNA修复机制修饰特定的基因。本文主要介绍ZFN在生产转基因猪研究中的应用及其未来的应用前景。目前采用传统的基因打靶和体细胞核移植的方法,科学家们已经获得了一批基因敲除猪。然而采用传统的基因打靶技术对哺乳动物体细胞进行遗传修效率较低,而且位点特异性和外源DNA整合效率都难以控制。ZFN能够结合到DNA特定位点上,并产生切割作用,使基因打靶的效率提高了几个数量级。本文将详细介绍目前应用ZFN技术获得基因敲除猪模型的几项研究,以及应用ZFN技术加快生产可用于农业生产和生物医药研究的转基因猪。文中还将讨论ZFN在猪的基因组遗传修饰中的安全性和有效性,以及ZFN技术在生猪产业中的创新性应用。     

一种快速稳定构建重组杆状病毒的方法

快速稳定地将外源基因插入杆状病毒基因组获得重组杆状病毒,是提高昆虫杆状病毒表达系统应用效率的关键技术之一。在Ac Bacmid的基础上,通过λRed同源重组技术敲除病毒基因组lef2和orf1629基因的3'端部分序列获得RDAc Bacmid-DualKo,并用Bsu36Ⅰ线性化之后,经重叠PCR获得5'端和3'端各含有50 bp同源臂及以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为外源基因的表达盒片段,再将线性化杆状病毒载体片段与表达盒片段共转染sf9细胞,3~4 d即可获得重组杆状病毒rvAcBacmid-GFP。SDS-PAGE和Western blot结果表明,被rvAcBacmid-GFP感染的sf9细胞能高效表达绿色荧光蛋白。该方法通过线性化复制缺陷型杆状病毒载体和携带有同源臂及外源基因的重叠PCR片段,在胞内完成同源重组获得重组杆状病毒,避免了繁琐的病毒空斑纯化和分子克隆操作,获得的重组杆状病毒中无不稳定因子BAC及影响下游应用研究的抗性基因,为快速构建重组杆状病毒高效表达外源基因及相关研究应用提供了新的技术平台。     

基因打靶备乳腺生物反应器研究进展

基因打靶技术是建立在胚胎干细胞和同源重组技术之上,可对基因组进行定点修饰的实验方法。用基因打靶技术制备乳腺生物反应器,克服了显微注射法的众多缺陷。本文简述了制备乳腺生物反应器过程中基因打靶的策略、靶细胞、打靶位点及国内外研究进展和展望等。     

动物转基因与核移植技术的新进展

本文就动物转基因与核移植技术进行文献回顾，原核注射是一种可靠、使用广泛的动物转基因方法，但该方法存在花费时间长、整合效率低及不能定点整合的问题。所以近年来出现了一些新的转基因方法，包括精子介导、反转录病毒介导、携带外源基因体细胞的核移植、ES细胞基因打靶技术等。这些方法中动物核移植技术贡献较大，很有前途。核移植技术解决了同源重组在大动物上的限制，可以应用于生物制药动物保种、预防遗传病、辅助生殖及治疗性克隆。     

新型基因组编辑技术研究进展

基因组编辑技术是一种能精确靶向修饰生物基因组,实现对基因定点敲除和外源基因定点整合的技术。新出现的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和规律性重复短回文序列簇与Cas9蛋白(CRISPRs/Cas9)系统3种新型的基因组编辑技术通过特异性结构识别靶位点,核酸酶发挥切割作用对靶位点进行定点编辑。3种新型基因编辑技术因具有高效准确、制作简单、耗时短等特点而在生命科学研究中得到广泛应用。论文对目前三种新型的基因组定点编辑技术的特点、结构原理、构建方法以及在传统生物模型、功能基因筛选、人类遗传病基因治疗等方面中的应用做一综述。     

基因打靶与体细胞克隆技术制备乳腺生物反应器的研究进展

在动物乳腺生物反应器研究中,传统方法不可避免地造成基因表达调控元件的人工拼接和外源基因在动物基因组中随机整合所带来的“位置效应”,致使转基因动物外源基因的表达水平不高且差异较大。而基因打靶在外源基因定点整合、消除位点效应方面具有明显优势。体细胞核移植技术可以提前在细胞水平对转基因动物进行筛选,不但可以节省时间,更降低了制备乳腺生物反应器的成本。作者简述了基因打靶与体细胞核移植技术结合制备乳腺生物反应器的优越性、存在问题、解决办法及其应用前景和展望。     

基因打靶制备乳腺生物反应器研究进展

基因打靶技术是建立在胚胎干细胞和同源重组技术之上，可对基因组进行定点修饰的实验方法。用基因打靶技术制备乳腺生物反应器，克服了显微注射法的众多缺陷。本文简述了制备乳腺生物反应器过程中基因打靶的策略、靶细胞、打靶位点及国内外研究进展和展望等。