对甜菜夜蛾具有杀虫活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

根据已报道的14个cry1Ca基因,设计能够扩增cry1Ca全长基因的简并引物。利用该引物对本实验室分离的472株Bt菌株进行筛选。PCR扩增发现22株菌含有cry1Ca基因。对22株菌株进行cry基因多样性分析,结果获得5种类型酶切图谱,表明这些菌株分为5种类型。SDS-PAGE结果显示22株菌均表达约130ku的蛋白。Western Blotting结果证实这些株菌中cry1Ca基因均正常表达。提取菌株的晶体蛋白,经胰蛋白酶活化,对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]进行初步生测,结果表明22株菌中活化的Cry蛋白对甜菜夜蛾均表现出很强的毒杀作用。进一步从5个类型的菌中各挑选一株毒力较高的菌株进行LC_(50)的测定,结果证实它们均具有很高毒力,其中,T1-E12(0.087μg/g)、B16-C8(0.103μg/g)、T1-B8(0.202μg/g)的活性与阳性对照菌株G03(0.090μg/g)相当,具有生产应用潜力。本研究为新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基础。     

北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因.     

对甜菜夜蛾高杀虫毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ah5的克隆表达

利用生物活性测定方法从本实验室已分离保存的Bt菌株中筛选出了5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的菌株。该5株Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC₅₀值为0.556~0.914mg/mL胞晶混合物,其中GS3菌株杀虫活性最高,LC₅₀值为0.556mg/mL胞晶混合物;包含晶体形态主要是球形、大菱形、小菱形等;所含基因类型主要是cry1Aa、cry1Ab、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ad、cry2Ah、cry7Ab、cry9Ba等;5株菌株均表达约60kD和130~150kD蛋白,其中2株还表达较弱的80kD蛋白。从GS3菌株中克隆得到一种新的cry2A基因,GenBank登录号为KT692984,由Bt基因国际命名委员会命名为cry2Ah5。该基因开放阅读框为1899bp,编码632个氨基酸,编码蛋白分子量为70.8kD,等电点pI为8.18,与其他Cry2Ah蛋白序列相似性为97%~99%。该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达约70kD蛋白,与预测分子量相符。本研究筛选得到5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的Bt菌株,克隆表达了一种新的cry2A基因cry2Ah5,为甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株及基因资源。     

对黏虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选及分析

为筛选对黏虫[Mythimna separata(Walker)]具有毒杀作用的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白,本研究提取Cry1类、Cry2类、Cry9类及Vip3A类等11种蛋白,通过人工饲料喂毒方法对黏虫进行生物活性测定。结果表明,Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白对黏虫具有杀虫活性,其致死中浓度依次为5.09、17.71、26.75、27.42及43.93μg/g;Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对黏虫生长具有抑制作用,其浓度为10μg/g时的体重抑制率分别为78.4%、79.0%、86.9%,浓度为100μg/g时的体重抑制率分别为92.8%、95.7%、96.7%;Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa蛋白对黏虫无显著活性。本研究为黏虫的生物防治奠定了基础,并为抗虫转基因作物的研究提供优良的候选基因。     

对草地贪夜蛾高毒力的苏云金杆菌菌株筛选

筛选对草地贪夜蛾高毒力Bt菌株,对于开发绿色高效防治草地贪夜蛾新产品具有重要意义。本研究从自行筛选的对夜蛾科害虫高毒力的Bt菌株资源中,选取9株菌株进行草地贪夜蛾室内毒力测定,并对高毒力菌株进行杀虫基因分析;选取室内毒力测定活性最高的3株菌株进行田间小区药效试验。结果表明,9株Bt菌株在药后7 d对草地贪夜蛾初孵幼虫均表现出显著的毒杀效果,LC50范围在0.07~3.38μg/g,其中毒力最高的3个菌株分别是KN50、KN11和KNR8,LC50分别为0.07、0.23和0.43μg/g,表现非常显著的致死效果;对KN50、KN11和KNR8等6种高毒力的Bt菌株的杀虫基因分析发现,他们都含有vip3Aa、cry2Ab、cry1Ac、cry1Ia杀虫基因。KN50、KN11和KNR8菌株的32000IU/mg制剂在田间对草地贪夜蛾表现出不同程度防效,其防效高低与室内毒力结果一致,其中KN50药后7 d防效最高,在200和400 g/667 m2下对1~3龄幼虫防效分别可达86.09%和95.22%,对不同龄期幼虫混发的防效为72.61%和86.59%。因此KN50、KN11和KNR8这3个菌株能作为备选高效菌株用于防治草地贪夜蛾新产品开发,为实现草地贪夜蛾的绿色防控、化学农药合理减替提供重要保障。     

Bt菌株FB的生物学特性及其cry、vip基因型鉴定

菌株FB是1株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis （Bt）。本研究通过扫描电子显微镜、大质粒电泳、总蛋白SDS-PAGE及菌株生长特征观察的方式研究了菌株FB特征,克隆得到了基因cry1Ia、cry1Ea、cry1Ab、cry2Ab和vip3Aa全长,依据全基因组测序结果得到了1个cry8基因部分片段,首次在Bt菌株中同时发现基因cry1类和cry8类,这五种基因推导的氨基酸序列与已知基因序列相比,最高相似性分别为99%、98%、99%、100%、99%,而cry8半长基因与已知基因仅为63%。生测结果表明,蛋白Cry1Ia、Cry1Ea和Cry1Ab对小菜蛾幼虫具有较高杀虫活性。     

对蛴螬有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的筛选与基因鉴定

为了寻找对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因资源,以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对蛴螬有活性的菌株,其中菌株C9对3种供试昆虫均有活性.光学及扫描电镜检测发现这些菌株均释放球形晶体.SDS-PAGE分析显示这些菌株均表达约130kD的蛋白.采用3种方法分析43株菌株的杀虫晶体蛋白基因类型,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;QC4等8株菌株只能用引物HRM8F/HRM8R获得高度保守区域约110bp的扩增产物,说明这些基因的5'端序列与已知基因差异较大.测序结果经BLAST分析显示,产物序列同cry8基因的相似性均在98%以上,但其全长基因类型还需要其它方法确定.菌株QCM的PCR-RFLF图谱不同于已发现的cry8基因,推测其中含有新基因.     

对暗黑鳃金龟成虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选

暗黑鳃金龟Holotrichia parallela是一种重要的农业害虫,其成虫和幼虫均能对多种作物造成严重危害。为筛选对暗黑鳃金龟成虫具有毒杀活性的Bt蛋白,本研究首先对暗黑鳃金龟成虫的生活习性进行观察,用浸泡蛋白的榆树叶饲喂成虫,建立了Bt蛋白对暗黑鳃金龟成虫的生物学活性测定方法;制备了6种Bt Cry8类杀虫晶体全长蛋白和胰蛋白酶消化蛋白,对暗黑鳃金龟成虫进行了杀虫活性测定。初筛结果发现Cry8Ga1原毒素和消化蛋白均对暗黑鳃金龟成虫具有较高毒杀活性,其在浓度1.0 mg/mL时对暗黑鳃金龟成虫的7 d校正死亡率分别为100%和55%。为更进一步确定Cry8Ga1蛋白的杀虫活性,进行了致死中浓度测定,7 d生测结果显示,Cry8Ga1原毒素的LC₅₀为0.387 mg/mL （95%置信区间为0.108~0.746 mg/mL）,Cry8Ga1蛋白经胰蛋白酶消化后的LC₅₀为0.702 mg/mL （95%置信区间为0.150~2.664 mg/mL）。取食Cry8Ga1原毒素蛋白及其消化蛋白后的暗黑鳃金龟成虫中肠细胞产生显著的病理学变化。本研究筛选到对暗黑鳃金龟成虫有毒杀作用的Bt蛋白,研究结果将为金龟子的生物防治开辟新的途径。     

对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。     

对草地贪夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株筛选与杀虫活性研究

草地贪夜蛾是一种世界性重大农业害虫,给玉米等多种主要粮食和经济作物造成严重危害.为实现对草地贪夜蛾的高效、绿色、持续防控,亟需筛选高毒力苏云金芽胞杆菌菌株资源.本研究以前期实验室储备的对斜纹夜蛾、小地老虎具有杀虫活性的363株野生菌株库为候选菌株,基于菌株杀虫基因差异及进化关系,去除冗余菌株后获得172株候选菌株.通过...     

青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云金杆菌晶体蛋白的能力

本文评估了Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca蛋白对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力,其LC50分别为0.442 5、0.675 7 μg/cm2和0.150 2 μg/cm2,Cry1Ba毒力最低,其次是Cry1Ab,而Cry1Ca毒力最高。青霉素影响幼虫对晶体毒素的耐受能力;一次添加高剂量(500 μg/cm2)青霉素于饲料中显著提高幼虫的耐受能力,以含低剂量(60 μg/cm2)青霉素的饲料饲养幼虫多代也能达到相似的效果。     

对斜纹夜蛾高效绿僵菌的筛选

对从土壤中分离到的金龟子绿僵菌中生长性状较好的6个菌株,通过测定对黄粉虫幼虫的僵虫率和致死中时,选出3株致病效果好的菌株M7-9、M7-(16-18)、M7-(64-65),再采用点滴法接种对斜纹夜蛾进行毒力测定。结果表明,不同菌株对斜纹夜蛾的毒力与菌株种类有密切关系,3株菌株对斜纹夜蛾的LT50分别为2.70、3.07、5.79d。以此3株菌进行抗高温及抗紫外线试验,菌株M7-9和M7-(16-18)对高温和紫外线都具有较好的抗性,且M7-9对紫外线的抗性强于M7-(16-18),两菌株均具有进一步研究的价值。     

苏云金芽胞杆菌毒素蛋白和粘虫颗粒体病毒对甜菜夜蛾中肠围食膜的破坏作用

利用扫描电镜和SDS-PAGE技术研究了苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)、粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)及其增效蛋白(enhancin)对甜菜夜蛾Spodoptera exigua中肠围食膜的影响.电镜观察结果表明,正常的甜菜夜蛾围食膜外壁有韧性,表面较平滑,少皱褶,内壁表面较粗糙,有较厚质感,无孔洞和缝隙;取食PuGV-Ps或增效蛋白后的围食膜外壁皱缩,内壁质薄;Bt单独作用于围食膜同样改变了围食膜结构,但影响程度较小;未发现不同处理对甜菜夜蛾围食膜造成穿孔或裂缝.SDS-PAGE结果表明,取食PuGV-Ps或增效蛋白后,围食膜上150kD蛋白一定程度被降解,27kD蛋白也被部分降解,而29kD蛋白被完全降解;取食Bt后的围食膜上29kD蛋白也被降解.离体降解试验进一步证明PuGV-Ps增效蛋白对甜菜夜蛾围食膜上多种蛋白具有降解作用,甜菜夜蛾围食膜上29kD蛋白是Bt和PuGV-Ps增效蛋白共同作用的靶标蛋白.     

高毒效杀甜菜夜蛾苏云金芽孢杆菌WY-190

从本实验室分离得到的406株苏云金芽孢杆菌中，以甜菜夜蛾为供试昆虫，采用生物测定的方法，筛选出一株对甜菜夜蛾高效的WY－190菌株，确定其发酵原液LC50为0.25μl/ml。对WY－190的形态特征，生理生化特性和伴孢晶体蛋白进行了观察和研究。研究结果表明，WY－190属于H3a3b血清型库斯塔克亚种；具有几丁质酶活性，伴孢晶体主要为大小不一的菱形，小正方形，椭圆形，并具镶嵌结构；SDS－PAGE电泳图谱表明主要由135kD和65kD两种蛋白成分组成，在菌株生长形态，发酵培养特征，生理生化特性方面与生产菌株HD－1的差别不大，共主要差异表现在对甜菜夜蛾的敏感性和杀虫毒力的差别上。     

具杀线虫活性的苏云金杆菌筛选研究

 Bioassay of 51 strains of Bacillus thuringiensis to Bursaphelenchus xylophilus had been studied in laboratory. Two of them had higher toxicity to B. xylophilus. Extraction of endotoxin and exotoxin of the two isolates to B. xylophilus showed the action of exotoxin higher than that of endotoxin.     

Activity of Bacillus thuringiensis toxins against cocoa pod borer larvae

Twelve Cry proteins from Bacillus thuringiensis Berliner were tested in bioassays on cacao plantations in Indonesia for activity against the larvae of cocoa pod borer (Conopomorpha cramerella (Snellen)), an insect pest of the cacao tree. Through the damage caused by their feeding, the larvae of cocoa pod borer cause the pods of the cocoa tree to ripen prematurely. They are difficult to control with conventional measures. Preliminary assays identified five toxins that were more active than others. In two subsequent bioassays the activity of selected toxins was determined more accurately. Three Cryl proteins with relatively little homology were all found to be toxic, opening perspectives for controlling cocoa pod borer by expression of Cry proteins in transgenic plants.