几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制

通过5种对家蚕微孢子虫发育有抑制作用的化学药剂--脓微灵、防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛不同处理时期、时间在体外对家蚕微孢子虫发育、增殖影响的研究表明：供试的5种化学药剂对家蚕微孢子虫体外发育、增殖均产生不同程度的抑制作用。脓微灵的显抑制作用的时期表现在从接种0h开始的处理区，孢子形成数仅为对照的11.89%～15.68%，主要体现为对微孢子虫、芽体的杀灭作用或对微孢子发芽的抑制作用。防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛对家蚕微孢子虫体外发生、增殖抑制作用最显的时期，均表现在接种24h～72h，从裂殖体分裂、增殖到孢子形成期之前这一对外界环境条件的变化最为敏感的发育阶段，尤以48h～72h最有效，其孢子形成数为对照的22%～38%。而抑制作用与化学药剂作用时间长短的相关性则不十分明显。     

35℃高温对家蚕微孢子虫在BmN细胞中发育、增殖的抑制

研究了 35℃高温处理对家蚕微孢子虫体外发育、增殖的影响时期和时间。结果表明 :35℃高温对家蚕微孢子虫体外发育、增殖具有明显的抑制作用 ,其最为敏感的时期是微孢子虫的裂殖体增殖阶段 (接种后 2 4～ 72h) ,进入孢子形成期 (接种 72h以后 )抑制作用则明显降低。     

家蚕丝腺单病斑的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)在昆虫细胞中的感染增殖观察

从家蚕丝腺上取下家蚕微孢子虫单病斑,将其接种于昆虫培养细胞(Sf21、BmN)中进行培养,并使其所增殖的微孢子在细胞中进行扩大培养和传代.同时,对家蚕微孢子在培养细胞中感染增殖及寄生细胞的形态变化进行观察.     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)与其它微孢子虫及真菌的进化关系

综述了应用分子生物学和生物信息学对家蚕微孢子虫系统发育的研究进展,以及多菌灵等苯并咪唑类杀真菌剂对微孢子虫和真菌的抑制作用,认为研究家蚕微孢子虫和真菌的进化关系对家蚕微粒子病的控制技术研究具有重要参考价值。     

粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)培养细胞对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的吞噬过程观察

观察微孢子虫在非天然宿主细胞系的生物行为过程,有助于探究微孢子虫的侵染特异性机制。选用鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞系为材料,接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)孢子后观察其吞噬过程。结果发现:经氢氧化钾发芽预处理的Nb孢子虽然可以在Tn培养细胞液中发芽,但未见发芽孢子的孢原质进入Tn培养细胞;在接种Nb孢子浓度为2.0×105mL-1以上时,观察到孢子通过内吞作用进入了Tn培养细胞,但未见孢子的增殖;随着时间的延长和进入Tn培养细胞的Nb孢子的增加,可引起Tn培养细胞的超微结构变化,并导致细胞的裂解。以上结果说明,虽未见Nb以发芽形式感染Tn培养细胞,但Nb能够被吞噬进入Tn培养细胞并破坏其结构。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)染色体DNA的分离纯化

为了获取可供家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)单染色体测序的基础材料,通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分离家蚕微孢子虫CQ1株系的染色体DNA,随后切取含有目的染色体DNA条带的琼脂糖胶块,分别利用电洗脱法、柱式胶回收试剂盒法及玻璃奶胶回收试剂盒法进行染色体DNA的分离纯化实验。结果显示3种方法均能回收到目的染色体DNA,但分离纯化的效率和样品质量存在差异:电洗脱法对胶块中的DNA损失较大,回收的染色体DNA含量低,而柱式胶回收试剂盒回收的染色体DNA断裂严重,因此这2种方法获得的样品质量均达不到染色体建库测序的要求;通过优化后的玻璃奶胶回收试剂盒法获得的染色体DNA相对完整且污染较少,质量检验分析133μL样品中的DNA质量浓度为8.495 ng/μL(DNA总量1.13μg),达到后续构建染色体测序文库的要求。玻璃奶胶回收试剂盒法不仅适用于家蚕微孢子虫染色体DNA的分离纯化,也可供基因组较小的物种制备单染色体建库测序材料参考。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白提取方法的优化研究

分别用SDS法、煮沸法、碱溶法和Brosson法,提取家蚕微孢子虫孢壁蛋白,并对孢壁蛋白及处理后的孢子形态进行比较研究。结果表明,不同方法处理后的孢子形态均保持完整,SDS处理后孢子为短杆状且明显变得粗壮,煮沸处理后孢子变小呈梭形,其他方法处理的孢子均有膨胀现象。SDS-PAGE检测显示,SDS法提取的孢壁蛋白出现3条明显的主带,煮沸法提取的孢壁蛋白出现5条明显的主带,0.1 mol/L KOH提取的孢壁蛋白出现2条主带;而Brosson法提取的孢壁蛋白呈现出20~30条带,体现了家蚕微孢子虫孢壁蛋白组成的复杂性,并适合于孢壁蛋白质组学的研究。     

家蚕微孢子原虫(Nosema bombycis)在Antheraea eucalypti细胞中的增殖

家蚕微孢子原虫（ Ｎｏｓｅ ｍ ａ ｂｏ ｍ ｂｙｃｉｓ） 经 Ｋ Ｏ Ｈ 处理后,接种于 Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞系,调查其生活史。 Ｋ Ｏ Ｈ 处理的孢子发芽率约为４４３ ％ 、 Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞的初期感染率约为３０ ％ ,接种３６ｈ 后,裂殖子数量急速增加,７２ｈ 达到最高峰。接种４８ｈ 后可观察到短极丝孢子发芽后形成的空孢壳和二次感染体。感染 Ｎｏｓｅｍ ａ ｂｏ ｍｂｙｃｉｓ ４８ｈ 前的家蚕血淋巴对 Ｂｍ Ｎ 细胞无感染性,而感染７２ｈ 的血淋巴则表现出感染能力。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染家蚕丝腺组织后的免疫胶体金标记观察

为了探讨家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究方法和手段,利用免疫胶体金标记电镜技术,对被感染的家蚕丝腺组织中家蚕微孢子虫的蛋白质分泌状况进行了观察。结果显示,有大量的胶体金颗粒存在于家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内,说明了家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质,证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。初步探讨了家蚕微孢子虫与宿主家蚕之间的互作关系。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。     

中国广东家蚕微粒子孢子在Antheraea eucalypti细胞系的感染增殖

将中国广东的Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ＣＧＳ,用０２ｍｏｌ／ＬＫＯＨ 处理后,接种感染Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞系。孢子的发芽率达８７％ ,在Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞初期感染率为２７ ％ 。发育各阶段具２ 核,可观察到短极丝孢子和二次感染体形成,孢子芽母细胞按二分裂形成２ 个双核的孢子芽,具典型 Ｎｏｓｅｍａ 属特征。Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ ＣＧＳ 生物学特性、血清学类型与日本Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ＮＩＳ００１ 大致相同,但孢子大小、裂殖体的形态、在Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉ 细胞寄生的细胞感染率、每个细胞的产孢数,２ 种微孢子虫却有差异。     

家蚕肠球菌体外抑制微孢子发芽的动力学研究

研究表明,家蚕微孢子的浓度(y)与孢子悬浮液的吸光值(OD_(625))(x)之间的函数关系可用y=2.712×1O~6x来表示,即可用分光光度计法快速准确地测定孢子的发芽率。微孢子在不同处理液中发芽的动力学曲线显示:经磷酸缓冲液、培养基的透析液或培养基的20％～80％饱和废硫酸铵盐析蛋白质处理微孢子在8min之内快速发芽;而经肠球菌培养上清液的透析液或培养上清液的20％～80％饱和度硫酸铵盐析蛋白质处理的微孢子在30min内发芽十分缓慢,两者对孢子发芽的最终相对抑制率分别达到65.95％和70.08％;抑制微孢子发芽的活性物为肠球菌的外分泌物,其分子量在3.5kD以上,具有良好的热稳定性。研究结果初步揭示了肠球菌外分泌物质抑制家蚕微孢子发芽的动力学机制。     

广消威对家蚕微孢子的消毒效果及机理研究

研究了含氯消毒药剂广消威对家蚕微孢子的杀灭效果。结果表明 ,广消威可有效杀灭家蚕微孢子 ,并且具有药效稳定、对金属腐蚀性弱等优点。对广消威的消毒机理进行了探讨 ,认为广消威不仅可以破坏家蚕微孢子的结构 ,而且还可使微孢子的可溶性糖大量外渗和蛋白质结构受到破坏 ,从而使微孢子失去致病能力     

家蚕微孢子虫感染BmN细胞的差异表达基因筛选及Akirin的原核表达

为探究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染宿主细胞的分子机制,以感染Nb的家蚕卵巢上皮细胞(BmN)为材料,通过GeneFishing技术进行基因差异表达分析,发现感染Nb的BmN细胞有10个基因被诱导或抑制表达,这些差异表达基因功能涉及蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体呼吸链电子传递、细胞能量代谢、细胞免疫及一些未知功能。运用RT-PCR方法克隆在感染Nb的BmN细胞中差异表达的免疫相关基因Akirin,获得一个长588 bp的完整ORF,编码195个氨基酸,预测蛋白质分子质量21.98 kD,等电点为8.97,属于碱性蛋白,该蛋白质经SignalP在线预测未见信号肽。通过原核表达获得家蚕Akirin的外源融合表达蛋白,为进一步研究家蚕Akirin在家蚕先天免疫系统中的功能奠定了基础。     

用铬变素2R法对家蚕微孢子虫孢子染色的研究

采用铬变素 2R法 (Chromotrope 2R)染色家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)孢子和绿僵 (Nomuraearile yi)孢子、曲霉 (Aspergillusflavus)孢子、花粉粒 (Pollengranule)等与N .b孢子形状相似物 ,结果表明 :Chromotrope 2R法特异性地将N .b孢子染成粉红色 ,绿僵孢子、曲霉孢子、花粉粒未被染成红色 ,初步认为Chromotrope 2R法可应用于母蛾镜检的N .b鉴定 ,能明显提高N .b的检出率与准确性 ;染色N .b孢子的最佳时间与温度为 4 0min ,30℃。鉴于本染色法的条件、技术操作简便 ,染色特异性强 ,因而具有良好的应用前景