杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化

采用正交设计的方法,对杨树ISSR-PCR反应中5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物)在4个水平上进行优化试验。建立了适合杨树的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有1×buffer,0.12mmol/L dNTP,0.4μmol/L引物,3.5 mmol/L Mg2+,1.5UTaqDNA聚合酶和40ng模板DNA。对杨树ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现引物W95142的最适退火温度为56.1℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术进行杨树种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

均匀设计优化毛竹EST-SSR PCR反应体系

本研究以毛竹叶片DNA为模板,利用均匀设计U10（54）表,对毛竹EST-SSRPCR反应体系的TaqDNA聚合酶、Mg2＋、dNTPs及引物浓度4因素5个水平进行优化筛选。优化实验结果表明,毛竹EST-SSRPCR的25μL优化反应体系为：10×PCRBuffer（含Mg2＋）2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5U,Mg2＋、dNTPs及引物的最适浓度分别是1.0mmol/L、0.1mmol/L、0.48μmol/L;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为52.4℃。对优化出的EST-SSRPCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰可辨的DNA谱带。该优化体系为利用EST-SSR分子标记对毛竹进行遗传多样性等相关研究工作提供了基础条件。     

利用正交设计优化黄菠萝ISSR-PCR反应系统

利用正交设计L16（45）对黄菠萝ISSR-PCR反应体系的5因素在4个水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS分析：1各因素的不同水平对PCR反应结果又显著影响,2筛选出各因素的最佳水平,建立了黄菠萝ISSR-PCR反应的最佳体系（20ul）为：Taq酶1.5U,Mg2＋2.0mmol/L,DNA40ng,dN TP0.15mmol/L,引物0.3μmol/L。     

观赏南瓜ISSR反应体系优化

以观赏南瓜为材料,对影响ISSR-PCR扩增的主要影响因子进行了优化,建立了适于观赏南瓜的ISSR反应体系:25μL反应体积中,2.0 mmol/LMg2 、0.25 mmol/LdNTPs、0.5U Taq DNA聚合酶、80ng模板DNA、0.6μmol/L引物;并通过梯度PCR试验确定了引物适宜的退火温度.     

雁鹅ISSR-PCR反应体系的优化*

本试验以雁鹅基因组DNA为模板,采用正交试验设计L25（55）对PCR反应中5个因素（引物、dNTPs浓度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶）在5个水平上进行优化实验,在初步实验的基础上通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,快速准确地建立雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系,为进一步进行雁鹅遗传多样性的研究、遗传图谱构建和基因定位奠定技术基础。在25uL的反应体系中,确定雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系为：ISSR引物的浓度为0.20umol/L,dNTPs浓度为0.28mmol/L,模板DNA的用量为40ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为1.0U。在正交试验设计的基础上,通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,可以更加准确地确立ISSR-PCR的最佳反应体系。     

利用正交设计优化黄菠萝ISSR-PCR反应系统

利用正交设计L16(45)对黄菠萝ISSR-PCR反应体系的5因素在4个水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS分析:1各因素的不同水平对PCR反应结果又显著影响,2筛选出各因素的最佳水平,建立了黄菠萝ISSR-PCR反应的最佳体系(20ul)为:Taq酶1.5U,Mg2+2.0mmol/L,DNA40ng,dN TP0.15mmol/L,引物0.3μmol/L。     

均匀设计试验法在内燃机试验中的应用

介绍了均匀设计试验法在内燃机试验中的应用。用均匀设计表安排了小型直喷柴油机供油系统中启喷压力和油嘴伸出量对性能影响的试验,经回归分析得到了最佳的试验结果。用单因素试验法证明了均匀设计方法的正确性,表明均匀设计试验法是安排多水平试验的良好方法,在内燃机中应用是完全可行的。     

毛薯ISSR-PCR反应体系的建立

本研究主要建立毛薯ISSR-PCR的最佳反应体系。研究采用改良CTAB法提取毛薯总基因组DNA,应用单因子实验法设定模板DNA,Mg2＋浓度,dNTP浓度,Tap酶浓度以及退火温度的5个不同梯度,探讨单因素变化对毛薯ISSR-PCR扩增的影响。实验结果表明,毛薯ISSR-PCR最佳反应体系为：总体积20μL,模板DNA为50ng、Taq酶为0.8U、Mg2＋浓度为2.0mmol/L、引物浓度为0.5μmol/L、dNTPs浓度为0.5mmol/L。     

药用菊花SRAP-PCR反应体系的优化

基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg2+、dNTP、引物和模板DNA等5因素4水平对药用菊花反应体系进行优化。结果标明：药用菊花SRAP-PCR的最佳反应体系为：在20μL的反应体系中,模板DNA 60ng,Taq酶1.00U,Mg2+ 2.00mmol•L-1,dNTP 0.20mmol•L-1,引物0.40μmol•L-1。Taq酶、Mg2+、dNTP和引物对SRAP反应结果有显著影响。所建立的药用菊花SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。     

栝楼ISSR－PCR反应体系的建立和优化

用改良SDS法提取栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）叶片DNA为模板,通过单因素试验研究模板、引物、Tat／DNA聚合酶和dNTPs等4因素各7个水平对栝楼ISSR-PCR扩增结果的影响,并通过正交试验对各因子的浓度进行优化,首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系：20μL的反应体系中,1×buffer,模板含量为50ng,引物的浓度为0．5μmol／L,TaqDNA聚合酶的用量为0．8U,dNTPs的浓度为200μmol／L。随机选取10条引物验证体系稳定性,并对190条ISSR引物初筛,得到条带清晰、多态性好的引物126条。经验证,本实验所建立的栝楼ISSR-PCR反应体系具有稳定可靠、可重复性好、多态性较强等特点,能够较好的应用于栝楼的ISSR分子生物学分析。     

37份龙眼种质资源亲缘关系的ISSR分析

本研究利用ISSR技术对37份龙眼种质资源进行遗传多样性检测。研究结果表明,从100条ISSR引物中筛选出7条重复性好,条带清晰的引物对37份龙眼品种基因组DNA进行扩增,共扩增出54条带,其中43条具有多态性,比率为79．6％。不同龙眼品种间遗传相似系数变幅为0．69～0．97,平均达0．83,说明ISSR标记能够揭示材料间较高的遗传多样性。UPGMA聚类结果表明,ISSR标记能将37份龙眼品种完全区分开,并能将来源于中国、越南和泰国的37份龙眼品种分别聚类到中国、越南和泰国三大品种群,说明龙眼品种资源的亲缘关系与地理因素有关,三个国家的龙眼品种之间存在较大的遗传差异。本研究结果将为为龙眼品种资源的研究利用提供参考。     

正交设计优化玉米SSR—PCR反应体系的研究

为建立适宜玉米SSR—PCR的反应体系和扩增程序,利用正交设计L16（4^5）表,对反应体系的模板DNA、dNTPs、Primers、Taq DNA聚合酶的浓度进行4因素4水平优化筛选和扩增程序的优化,确立了最优反应体系和扩增程序。即在10μL体系中,模板DNA20ng,1×PCR buffer,dNTPs62．5pmol／μL,Primers0．25pmol／μL,Taq DNA polymerase0．5U。反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性45S,60℃退火45S,72℃延伸1min,32个循环;72℃延伸5min,4℃保存。使用300对SSR引物对重组近交系的两亲本扩增,筛选出条带清晰,有差异的引物94对,用于基因连锁图谱构建和QTL定位。     

萘对松前水稻（OryzasativaCV．生理的影响及其残留Matsumae）生长和

以松前水稻为试验材料,研究了5种浓度萘污染土壤对松前水稻生长和生理生化指标的影响,以及植物成熟期时土壤中萘的残留。结果表明：①萘浓度低于20mg·kg^-1时促进幼苗茎径、茎长、株高的生长,高浓度对其生长有显著的抑制作用。②萘胁迫对水稻叶片游离脯氨酸和蛋白质代谢均有一定的影响,且影响程度以苗期最为明显,其次是分蘖期和拔节期;水稻幼苗阶段萘的高浓度组MDA累积量极显著高于对照,水稻幼苗阶段受到膜脂过氧化影响较为显著,分蘖期次之;拔节期水稻开始新生器官,抗性较弱,萘胁迫产生的过氧化作用超过了水稻的承受范围,使SOD活性显著降低。③在试验所设萘浓度范围内,水稻各生长期叶片叶绿素和光合作用速率均呈不同的变化趋势,但是变化幅度均不超过对照的±5％,说明萘胁迫对松前水稻的光合作用没有显著影响,水稻对萘胁迫有一定的耐受性。④经过水稻一个生长周期,萘在种子中的残留量最多,其次是根部,且土壤中萘各浓度组的残留量与对照组均无显著差异;水稻根部和种子中萘的含量均随萘浓度的增加呈先增加后逐渐降低趋势,但各浓度组均高于对照组,20mg·kg^-1时均达到最大值,分别为对照组的0．37倍、4．27倍。     

砀山酥梨果实COMT基因的克隆和表达分析

梨果实石细胞的发育和木质素的合成、转运及沉积密切相关。咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)是木质素合成途径中的1种关键酶,主要参与紫丁香基木质素(syringyl lignin,S-木质素)的生物合成。本研究以砀山酥梨果实为材料,利用RT-PCR技术并结合RACE方法,得到砀山酥梨COMT基因的全长c DNA,命名为Pb COMT(Gen Bank登录号为KC905086)。该基因全长1 371 bp,开放阅读框为1 098 bp,编码365个氨基酸。进化树分析发现砀山酥梨COMT蛋白具有很高同源性,与苹果的相似性达到94%。将该基因重组到表达载体p ET-32a(+)中进行原核表达,电泳检测到1条大约60.0 k D的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。荧光定量表达分析得知,梨果实Pb COMT基因表达量变化与木质素的含量变化趋势基本一致,并且和石细胞发育规律有很大的相关性。本研究为阐明梨石细胞发育分子机理奠定基础,为分子调控石细胞含量、改善梨果实口感提供了科学依据。     

不同生态区烟草叶片基因表达谱的分析

烟叶香气类型受到生态环境和栽培条件的影响,为解析生态环境对烟叶香气风格形成的影响,本研究利用定制的烟草(Nicotina tabacum L.cv.)芯片对种植在河南平顶山(浓香型)、云南省玉溪(清香型)和贵州遵义(中间香型)3个不同生态区的同一烟草品种K326的同一叶位(中部叶)、相同叶龄(60 d)的叶片基因表达谱进行了比较研究,共发现有效差异表达基因920个。通过功能注释和代谢途径分类发现,初生代谢途径中碳水化合物的代谢可能对不同香型风格烟叶的形成起到了较大影响作用,而氮代谢的影响较小。而在次生代谢中,苯丙烷类合成、生物碱合成、萜类代谢途径起到较大的作用。另外,氨基酸的代谢可能也对不同香型风格烟叶的形成起到了重要作用;其中,光合作用中起到重要作用的磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase 1,PPC1)、碳水化合物中淀粉代谢相关的细胞壁转化酶(cell wall invertase 1,CWINV1)、萜类代谢关键酶3-羟-3甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coA reductase,HMGR1)和萜类合成酶(terpene synthase 21,TPS21)、以及生物碱合成相关基因均在河南平顶山烟叶中表达量最高,贵州遵义次之,云南玉溪最低;类胡萝卜素合成关键基因八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)的表达量在河南平顶山最低,其次是云南玉溪,在贵州遵义表达量最高。而类胡萝卜素降解关键酶9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED4)基因表达量表现出云南玉溪最高,贵州遵义次之,河南平顶山最低。淀粉降解相关的葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase,PHS1)基因在云南玉溪表达量最高,河南平顶山次之,贵州遵义最低。结果提示,这些基因的差异表达可能对不同香型风格烟叶的形成起到了重要作用,该研究为进一步采用农艺措施调控提供了理论支撑。     

比利时杜鹃花花青素合成酶基因(RhANS)克隆及其功能分析

花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（...     

棉花MADS-box蛋白基因（GhMADS-13）的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作,以中棉所36（CCRI）均一化全长cDNA文库为基础,结合EST测序分析,分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA。该基因cDNA全长1079bp,包含一个732bp的完整的开放阅读框,编码234个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域和完整的K区,命名为GhMADS-13（GenBank：FJ409870）。与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性。实时定量RT-PCR分析表明,GhMADS-13在CCRI36的花器官发育中早期表达量逐步增加,后期有下降趋势。推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用。     

不同施肥处理对梁平柚产量、品质和土壤肥力的影响

通过连续3 a (2014—2017年)的田间试验,以10 a生梁平柚为研究对象,研究不施肥(CK)、单施化肥(CF)、50%化肥+50%有机肥(CF+OF)和单施有机肥(OF)下梁平柚产量、品质和土壤肥力的影响。结果表明,在不同施肥处理中,CF+OF、OF和CF的单果重均无显著性差异(P>0.05),但CF+OF的柚子单株果实数最高,柚子产量分别高出OF、CF和CK 8.2%、31.2%和11.82%;CF+OF处理中,柚子果实中的果汁含量、总糖、游离氨基酸和维生素C比CK分别提高20.40%、18.95%、64.34%和27.06%,而柚子果皮厚度、种子数和总酸度显著降低,品质改善;施肥显著提高土壤微生物生物量碳氮,在不同施肥处理中,微生物生物量碳氮比介于7.39～13.89,且差异显著(P<0.05)。CF+OF处理中,柚子成熟期土壤可培养细菌、真菌、放线菌数量显著高于或相似于单施化肥,说明化肥和有机肥配施能促进微生物生长繁殖,协调土壤养分供应,改善柚子营养。虽然不同施肥处理对土壤pH无显著影响(P>0.05),但是与CK相比,OF和CF+OF处理有机质和速效钾...     

枯萎病菌侵染后香蕉乙烯形成酶基因MaA CO及乙烯响应因子MaERF1表达水平分析

香蕉与枯萎病互作机理研究一直是近年来研究的热点,目前对枯萎病菌的致病机理及香蕉的感、抗病机理还不清楚。本文利用前期表达谱分析结果克隆了乙烯合成及调控途径中的关键酶基因乙烯形成酶基因（MaACO）和乙烯响应因子基因（MaERF1）,通过RT-PCR检测,对这两个基因在感、抗病香蕉种质中的表达水平进行研究。结果表明,MaACO和MaERF1基因对机械损伤非常敏感,尤其在损伤初期（3h）的表达水平远高于后期;对于枯萎病菌侵染处理的植株,尤其在感染初期（3h）MaACO和MaERF1的表达水平在抗性植株中的表达量均比感病植株中的低;抗性种质中乙烯途径可能受到抑制,香蕉的感病性可能与侵染初期对乙烯信号的敏感性相关。本研究为利用乙烯抑制剂进行香蕉抗枯萎病新方法的研究奠定了基础。     

水稻CAT与逆境应答关系及酶活性分析

通过氧化氢酶（catalase,CAT）是一种四聚体血红素酶,主要存在于过氧化物酶体与乙醛酸循环体及相关细胞区域内。水稻中含有CAT1、CAT2和CAT3三种主要同工酶。它们在各组织不同的发育阶段,发挥着重要作用。在本研究解析了水稻过氧化氢酶同工酶基因在NaCl、NaHCO3、Na2CO3、PEG6000、H2O2、低温等逆境处理下mRNA表达特性。结果表明在不同的逆境下过氧化氢酶同工酶在表达上存在差异性。同时利用蛋白表达系统,对水稻过氧化氢酶CAT1和CAT3蛋白进行了纯化实验,对纯化的蛋白的酶活性分析的结果表明,CAT1和CAT3的酶活性没有十分显著的差别。