蜡样芽孢杆菌特征性蛋白的分离与纯化

蜡样芽孢杆菌是一种致病性病原菌,能引起胃肠感染和非胃肠感染。本研究从实验室分离的蜡样芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌1.026 0、巨大芽孢杆菌1.015 1、蕈状芽孢杆菌1.085 6和苏云金芽孢杆菌1.101 4这五株菌中提取蛋白,利用SDS-PAGE方法纯化,并测定出蜡样芽孢杆菌有3种分子量约为28.5、26.5和20.0 KDa的特征性蛋白,而苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌则没有此特征性蛋白。     

食品中蜡样芽孢杆菌检验方法验证结果分析

[目的]验证国标平板计数法、最大或然数(most probable numbe, MPN)计数法检测食品中蜡样芽孢杆菌的适用性。[方法]参照GB 4789.14—2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》中平板计数法、MPN计数法检测样品中蜡样芽孢杆菌浓度，对比不同方法的检测结果。同时以蜡样芽孢杆菌为阳性对照，蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌为阴性对照，验证方法的特异性。[结果]该方法具有特异性，能够准确检出蜡样芽孢杆菌的计数，方法精密度和重复性好，回收率在84%～100%。[结论]2种方法均具有适用性和可操作性，均能达到标准方法要求的技术指标水平，检验结果准确可靠。     

常见几种芽孢杆菌产淀粉酶的比较

探索地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌产生淀粉酶的能力,以筛选和研制动物微生态制剂和饲料添加剂的使用菌种。将各菌种接于淀粉酶试验培养基,培养后滴加稀碘溶液,观察透明圈,判定产酶能力。结果:地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌都能产生淀粉酶,以蜡样芽孢杆菌产生的淀粉酶较多,认为4种常见芽孢杆菌产淀粉酶能力依次为:蜡样芽孢杆菌>纳豆芽孢杆菌>枯草芽孢杆菌>地衣芽孢杆菌。     

牛奶中蜡样芽孢杆菌的分离和鉴定

蜡样芽孢杆菌是乳制品中容易污染的一种致病菌。为了鉴定市售牛奶中是否含有蜡样芽孢杆菌,该研究通过生化和分子生物学鉴定方法对牛奶中蜡样芽孢杆菌进行了分离和鉴定。结果表明,市售牛乳中分离、鉴定了一株蜡样芽胞杆菌,这表明蜡样芽胞杆菌对牛奶产品具有较大的食品安全风险。     

基于实时荧光PCR技术快速检测饲料中的蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在自然界中广泛存在,而且大部分菌株能产生肠毒素和呕吐毒素,是引起养殖动物中毒的常见致病菌。在饲料生产过程中,为对该病原菌进行有效监控,以蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因(entFM)和肠毒素T基因(bceT)保守区域片段为靶序列,利用DNAMAN设计两对特异性引物,建立一种基于实时荧光PCR (real-time PCR)技术的蜡样芽孢杆菌快速检测方法,并对所建立方法的重复性、特异性及灵敏度进行分析。结果表明:所设计的引物可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测而且具有较高的重复性;对8株蜡样芽孢杆菌和8株非蜡样芽孢杆菌共16株菌株进行特异性检测,8株蜡样芽孢杆菌检测全部为阳性,8株非蜡样芽孢杆菌检测全部为阴性,无漏检和误检现象;对纯培养条件下蜡样芽孢杆菌提取的DNA模板进行10倍梯度稀释并进行灵敏度检测,两种肠毒素基因的检测限均为1.0×10~4CFU·mL~(-1);对人工染菌的饲料样品进行检测,在增菌18～20h后进行实时荧光PCR检测,检测限均可达到10CFU·mL~(-1),证明该方法具有良好的特异性和灵敏度,是快速检测饲料中蜡样芽孢杆菌的有效方法。     

溶菌酶快速诱导蜡样芽孢杆菌L型的研究

[目的]研究溶菌酶诱导蜡样芽孢杆菌L型的技术条件。[方法]利用溶菌酶诱导蜡样芽孢杆菌L型,观察其形成、形态、生长及其对渗透压的敏感性等特性。[结果]在培养基中加入2 mg/ml的溶菌酶能够较好地诱导蜡样芽孢杆菌L型的产生,通过连续的培养获得了稳定的L型蜡样芽孢杆菌。L型蜡样芽孢杆菌呈球状,革兰氏染色阴性,对渗透压敏感。[结论]确定了蜡样芽孢杆菌溶菌酶法诱导L型的最佳浓度。     

淀粉质食品中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定

[目的]分离鉴定淀粉质食品中的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).[方法]以淀粉质食品(低温保藏的米饭)为原料,采用传统方法对米饭中蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定,使用PCR技术做最终确定.[结果]对低温保藏米饭进行系列稀释后在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上进行菌种分离,初步分离出菌株MF-2,表面光滑稍有光泽,呈现低凸起形,边缘呈现锯齿状,菌落形状可形成近似圆形、质地松软、无色素,菌落颜色为乳白色不透明;经革兰氏染色为阳性,镜检为杆状;经芽孢染色为有芽孢杆菌;MF-2号菌能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖,并产酸,但不能分解D-甘露糖和α-乳糖,初步鉴定菌株MF-2为蜡样芽孢杆菌.由16S rRNA基因序列同源性分析,结合形态观察和生理生化鉴定,最终鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).[结论]研究可为食品质量安全提供理论和实践依据.     

微流控芯片恒温扩增技术快速检测米饭中的蜡样芽孢杆菌

为建立米饭中的蜡样芽孢杆菌微流控芯片恒温扩增快速检测方法,利用蜡样芽孢杆菌公开的hblA基因序列设计引物,加入荧光染料SYTO-9,采用微流控芯片通过环介导恒温扩增进行实时荧光读数,并通过24株菌株验证其特异性;分别用阳性质粒和阳性菌株测试其灵敏度、检出限和重复性。结果表明:2株蜡样芽孢杆菌呈阳性,22株非蜡样芽孢杆菌呈阴性;微流控芯片恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌菌液的灵敏度为170 CFU/mL,检测时间在35 min内;使用合成的蜡样芽孢杆菌阳性质粒样品,其灵敏度为10μL-1,检测时间在15 min内,比传统分离鉴定方法的灵敏度高10倍;人工污染米饭中蜡样芽孢杆菌的检出限为570 CFU/g,并可在45 min内完成结果判定;蜡样芽孢杆菌阳性质粒检测重复性好,其变异系数(coefficient of variation, CV)为2.02%。综上所述,微流控芯片恒温扩增快速检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,可用于米饭类食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测。     

生防细菌蜡样芽孢杆菌BCCY-22发酵条件优化

【目的】蜡样芽孢杆菌BCCY-22是有效防治多种线虫病害的生防细菌。本研究旨在探明生防菌蜡样芽孢杆菌BCCY-22的最优培养条件,为实现该菌株的高效发酵奠定基础。【方法】以蜡样芽孢杆菌BCCY-22的OD600为指标,采用单因素试验和响应面法对该菌株发酵条件进行优化。【结果】高温、低初始pH和供氧不足显著影响蜡样芽孢杆菌BCCY-22的生长,最适发酵条件：发酵温度21.5℃、初始pH 7.3、种子液接种量3%、装瓶量23%、发酵时间36 h。【结论】蜡样芽孢杆菌BCCY-22优化发酵条件后,缩短了发酵时间6 h,生物量是优化前的135.94%,研究为蜡样芽孢杆菌BCCY-22生防菌的发酵生产和开发利用提供了依据。     

蜡样芽孢杆菌致吐毒素的毒性作用与生物合成研究进展

蜡样芽孢杆菌是一类兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,可以产生芽孢抵抗不良环境,并广泛存在于土壤、水、空气和多种食物中。致病性蜡样芽孢杆菌是常见的食源性条件致病菌之一,其引发的食物中毒主要是由其产生的毒素导致的。致吐毒素cereulide是致病性蜡样芽孢杆菌产生的重要毒素之一,是一种小分子亲脂性十二环肽,结构性质十分稳定。Cereulide能够引起恶心、呕吐等轻微的食物中毒症状,也可导致如肝性脑病、急性肝脏衰竭等严重致死的疾病。当前对于cereulide的毒性作用机制研究局限于其刺激传入迷走神经引起呕吐症状,以及作为钾离子载体,诱导线粒体膜电位丧失,并最终导致细胞死亡,而对于其导致的严重肝脏和脑部病变的毒性作用机制研究仍十分不足。Cereulide是由cereulide合成酶基因簇(ces)编码,非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide-synthetase, NRPS)系统控制合成的。Cereulide由两个羟基酸和两个氨基酸残基[-D-HIC-D-Ala-L-HIV-L-Val-]经3次迭代组成三聚体缩酚酞,其结构特殊并有很强的代表性,但因NRPS合成系统的灵活性会产生许多变体,因此cereulide的毒性与其生物合成过程息息相关。文章在现有文献报道和研究数据的基础上,总结并提出了cereulide的生物合成机理：首先,cereulide合成基因簇的CesA和CesB结构域分别识别D-α-酮羧酸、L-丙氨酸、L-α-酮异戊酸和L-缬氨酸,通过共价结合形成cereulide的主要合成单元二肽;其次,依照上述过程重复合成四肽;再通过重复反应合成第二个四肽,两个四肽通过酯化形成八肽;再次重复上述反应,形成三元络合的产物肽;最后,由于ces-NRPS的硫酯酶结构域活性中心表面结构阻止外部水分子进入,并诱导内部亲核攻击反应,最终释放出环状cereulide。目前,由产cereulide的蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒风险被低估。并且,本团队前期研究发现部分芽孢杆菌微生态制剂中混有产cereulide的蜡样芽孢杆菌菌株。因此,产cereulide蜡样芽孢杆菌的存在对食品安全和公共健康均构成了潜在风险。文章综述了cereulide的毒性作用及机制,为进一步研发cereulide防控措施提供科学依据;总结并提出了cereulide的生物合成机理,强调了催化酮酸形成酯的酮还原酶域(KR),及形成重复单元和环肽的硫酯酶域(TE)在其合成中的重要作用,为阐明类似结构的非核糖体肽合成提供新的思路。     

蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌的体外抑制研究

本试验通过蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时接种及分别先后接种等3种不同的接种方式分别于4h,8h、12h、24h,36h、48h等6个时间点观察抑制效果，以确定最佳接种方式。研究表明，先接种蜡样芽孢杆菌后接种大肠杆菌，抑制作用最强；蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时接种次之；先接种大肠杆菌后接种蜡样芽孢杆菌，抑制作用最弱。并且每种接种方式都在12小时左右出现抑制高峰。     

一株猪源致病性蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定

无菌采集流行性腹泻耐过仔猪的肝脏样本,经无氧及有氧培养获得一株疑似蜡样芽孢杆菌的纯培养物,命名为HN1203。16SrDNA序列(GenBank登录号为JX294967)分析表明,HN1203为蜡样芽孢杆菌群第7基因型菌株。生化鉴定结果表明,该菌的生化特性符合蜡样芽孢杆菌群成员的特征。药敏试验和伴孢晶体蛋白检测结果表明,该菌对链霉素和四环素敏感,对青霉素不敏感,其芽孢不形成伴孢晶体。多位点序列分型(MLST)检测结果表明,该菌带有蜡样芽孢杆菌看家基因pta新的等位基因pta153,序列基因型为ST611。毒素基因的PCR检测结果表明,该菌携带肠毒素基因(hbl、nhe和entFM)和细胞毒素K基因(cytK)。综合以上结果,分离菌为一株新的蜡样芽孢杆菌,且提示分离培养蜡样芽孢杆菌时,不宜采用常用的有氧条件。进一步动物试验结果表明,该分离菌株能够致死实验小白鼠。提示生产实践中应该重视监控猪源致病性蜡样芽孢杆菌的潜在危害。     

微囊化蜡样芽孢杆菌的喷雾干燥工艺优化

[目的]提高蜡样芽孢杆菌在压力喷雾干燥过程中的存活率,优化喷雾干燥工艺。[方法]以微囊化的蜡样芽孢杆菌为材料,考察进风温度、进料流量、料液比、喷枪孔径等对喷雾细胞存活数的影响。[结果]当进风温度为140℃,进料流量为1.5 t/h,料液比为1∶5,喷枪孔径为2.5 mm时,蜡样芽孢杆菌的存活率最高,达81%。[结论]该研究确定了蜡样芽孢杆菌的最佳喷雾干燥工艺条件。     

蜡样芽孢杆菌启动子片段克隆及转录活性分析

为研究蜡样芽孢杆菌基因的转录调控特征,通过鸟枪法和蓝白斑筛选,获得57个蜡样芽孢杆菌启动子片段,并以β-半乳糖苷酶为报告基因,比较了这些启动子片段在大肠埃希菌中的转录活性。对转录活性较高的4个启动子克隆片断进行测序、序列比对、特征分析,发现这4个克隆序列具有启动子元件、核糖体结合序列特征,其中2个克隆序列在枯草芽孢杆菌也表现出活性,表明兼有蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌RNA聚合酶σ因子序列识别特征。     

能引起食物腐败的微生物有哪些?

<正>由于食物的性质、来源和加工方式不同,引起食物腐败的微生物也各有差异。通常细菌、霉菌、酵母都能引起食物腐败,因细菌和霉菌引起的食物腐败最为常见。引起腐败的细菌包括各种需氧性芽孢杆菌和厌氧性梭状芽孢杆菌,由于它们能产生芽孢,对热的抵抗力特别强,是一些加热后罐藏食品的主要腐败菌;非芽孢杆菌,如大肠杆菌、变形杆菌和液化链球菌等,它们不产生芽孢,热抵抗力弱,是新鲜食品、冷藏食品的常见腐败菌。     

芽孢杆菌生物防治植物病害研究进展

综述了枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和多粘芽类芽孢杆菌等芽孢杆菌防治植物病害的研究和应用现状;分析了芽孢杆菌防治植物病害的主要作用机制,包括拮抗作用、竞争作用、诱导植物系统抗性等方面;总结了生防芽孢杆菌的遗传改良研究进展,并对芽孢杆菌及其制剂在生物防治领域的发展前景进行了展望。     

1株益生蜡样芽孢杆菌发酵培养基优化研究

[目的]通过优化蜡样芽孢杆菌的发酵培养基,提高蜡样芽孢杆菌的生物量。[方法]在初始发酵培养基的基础上,通过单因素试验和正交试验确定蜡样芽孢杆菌发酵培养基的最适碳氮源和碳氮比。[结果]优化后的发酵培养基为:葡萄糖15.00 g/L,可溶性淀粉40.00 g/L,蛋白胨10.00 g/L,玉米浆干粉30.00 g/L,硫酸铵3.00 g/L,磷酸氢二钾5.00 g/L,磷酸二氢钠5.00 g/L,硫酸镁1.25 g/L,硫酸锰0.60 g/L,氯化钙2.00 g/L。优化后蜡样芽孢杆菌在50 L不锈钢发酵罐中的发酵液活菌数达1.6×1010cfu/m L,较优化前提高了1个数量级。[结论]优化后的蜡样芽孢杆菌发酵培养基大大提高了该菌的生物量,为工业化放大生产提供了参考。     

乳源蜡样芽胞杆菌耐药性、毒力因子检测及分子特征研究

为了解乳品来源蜡样芽胞杆菌携带的毒力因子、分子特征及耐药性,对2016—2019年分离自乳品的122株蜡样芽胞杆菌,采用纸片扩散法（K-B纸片法）测定了分离株对氯霉素、庆大霉素等9种抗生素的耐药性,使用聚合酶链式反应法检测了菌株携带的毒力因子,同时采用脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）检测分离株的分子特征。结果表明,122株蜡样芽胞杆菌均对氯霉素、庆大霉素、阿米卡星敏感;对红霉素、克林霉素和环丙沙星的中介率分别为5.74%、4.92%和0.82%, 9.84%的菌株对复方新诺明具有耐药性,8.20%的菌株对四环素具有耐药性,4.10%的菌株对利福平具有耐药性。122株蜡样芽孢杆菌都检出了蜡样芽孢杆菌的非溶血型肠毒素基因nheA、nheB及肠毒素FM基因entFM;nheC、bceT、cytK、hblA、hblC、hblD、ces和EM1基因的检出率分别为99.18%、37.70%、31.15%、29.51%、24.59%、8.20%、、6.56%和6.56%。122株蜡样芽胞杆菌被分成15簇,未见明显的优势带型。由此可见,2016—2019年收集的蜡样芽胞杆菌乳品分离株携带多种毒力基因,约10%的菌株对复方新诺明、四环素、利福平等具有耐药性,PFGE呈现多种带型,为蜡样芽孢杆菌引起的食源性疾病的预警、预防和治疗提供参考。     

土壤中抗生素产生菌的分离、鉴定及抗菌活性分析

从土壤中分离得到7株抗生素产生菌,对7株抗生素产生菌进行16S rDNA和18S rDNA测序。结果表明,菌株S1～S7分别为产红青霉、杂色曲霉、委内瑞拉链霉菌、山丘链霉菌、墨西哥链霉菌、华丽黄链霉菌和溶藻链霉菌。对7株抗生素产生菌进行抗菌试验,结果表明,S1和S5对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌有抑制作用,S2只对大肠杆菌有抑制作用,S3对蜡样芽孢杆菌、粪链球菌有抑制作用,S4和S7对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、粪链球菌、酿酒酵母有明显的抑制作用,S6对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、粪链球菌有较明显的抑制作用。     

虾源蜡样芽孢杆菌D7的生态安全性评价

为了评价蜡样芽孢杆菌菌株D7的生态安全性,分别测定了蜡样芽孢杆菌D7对氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐浓度的影响,以及对小球藻、大型蚤、斑马鱼、凡纳滨对虾和草鱼等水生动植物的安全性。研究结果表明,蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度≥1×10⁷ cfu·mL^-1时,水中氨氮及亚硝酸盐含量显著降低(P<0.05)。蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度≤1×10⁶ cfu·mL^-1时,对氨氮及亚硝酸盐含量无显著影响。蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度在10⁴~10⁸ cfu·mL^-1时,水中磷酸盐含量无显著变化。小球藻含量与菌体浓度呈正相关。处理96 h,对大型蚤、斑马鱼和凡纳滨对虾死亡率均无显著影响。以不同细菌剂量(10⁸~10¹² cfu·mL^-1)灌胃草鱼,处理96 h后,未出现草鱼死亡现象。表明虾源蜡样芽孢杆菌D7生态安全性较好,对水体及养殖动物无明显危害。