水稻干尖线虫SPRYSEC基因的克隆及表达定位分析

效应蛋白是线虫食道腺分泌物的重要组分,广泛存在于植物寄生线虫中,在线虫整个生长发育及侵染寄生中起到重要作用。根据水稻干尖线虫转录组测序结果,并通过RACE法从水稻干尖线虫中克隆到一SPRY基因,命名为Ab-SPRYSEC。该序列全长为2089 bp,包含一个1962 bp的开放阅读框(ORF)。预测编码653个氨基酸,蛋白相对分子量为72.009 kDA,理论等电点为4.82,不稳定指数41.5,属于不稳定性蛋白;保守区预测分析表明,该蛋白含有B302_SPRY和CTLH两个保守结构域,属于SPRY超家族;多序列比对分析表明,该基因编码蛋白与马来丝虫的SPRY(XP_001891979.1)蛋白相似度最高为43 %;蛋白结构分析表明,β-折叠与无规则卷曲是Ab-SPRYSEC蛋白主要结构元件;表达定位分析显示,Ab-SPRYSEC基因的表达位置在水稻干尖线虫食道腺附近。Ab-SPRYSEC基因作为水稻干尖线虫一效应因子,可能在水稻干尖线虫侵染宿主中发挥了重要作用。     

水稻干尖线虫翻译控制肿瘤蛋白基因的克隆及表达分析

根据转录组测序结果,结合RT–PCR及RACE技术,从水稻干尖线虫中克隆出翻译控制肿瘤蛋白(The translationally controlled tumor protein,TCTP)基因Ab–TCTP。该基因序列全长810 bp,开放阅读框长度为546 bp,编码181个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为20 930,等电点为4.68;Ab–TCTP蛋白属于稳定性蛋白,没有信号肽和跨膜区域,亚细胞定位于细胞核中;该蛋白功能区域的氨基酸序列较为保守,含有TCTP保守结构域,属于TCTP超家族(TCTP superfamily)。多序列比对分析结果表明,Ab–TCTP蛋白与秀丽隐杆线虫TCTP蛋白(XP_003112086.1)的覆盖度为100%,相似度为78%。系统进化树分析结果表明,该蛋白与秀丽隐杆线虫TCTP蛋白(XP_003112086.1)在同一分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验结果显示,杂交处理后的线虫在其食道腺附近颜色加深,TCTP基因主要在水稻干尖线虫的食道腺附近表达。利用鱼藤酮对水稻干尖线虫进行药剂处理试验,24 h时LC50值为2.20μg/m L。实时荧光定量PCR结果显示,鱼藤酮处理12 h和24 h后,TCTP基因的表达均上调,且处理24 h时的表达量大于处理12 h时的表达量。推测该基因参与了水稻干尖线虫的应激反应。     

水稻种子携带水稻干尖线虫研究

对辽宁省主要水稻品种的种子上携带水稻干尖线虫（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）的情况进行了初步研究，结果表明来自盘锦的浓农５３８和沈农４８１及自来沈阳市苏家屯区的辽粳２０７等３个品种的种子上携带有水稻干尖线虫。该种线虫主要以幼虫和成虫在干燥的水稻种子的颖壳体休眠越冬。携带水稻干尖线虫的水稻种子中，种皮无褐点籽粒饱满的种子上携带水稻干尖线虫量较大。     

水稻干尖线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因抗缺氧表达

根据转录组测序结果,克隆到水稻干尖线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因(Ab-GPX),对其基因结构、在缺氧条件下的表达模式及功能进行研究.原位杂交结果表明,Ab-GPX在水稻干尖线虫生殖系统部位表达.RT-PCR结果表明,Ab-GPX在缺氧胁迫及恢复供氧过程中表达量上调.利用基因沉默技术进一步研究发现,Ab-GPX沉默后,水稻干尖线虫在缺氧条件下存活率显著下降,表明该基因可能参与调控水稻干尖线虫的缺氧隐生状态.     

水稻感染干尖线虫后植株表型特征及减损分析

水稻干尖线虫是水稻上重要的寄生线虫,严重危害水稻安全生产,准确识别该病害与病原在制定防控策略方面尤为重要。为了更好地在实际生产中认识水稻干尖线虫田间发生与危害情况,采用水稻干尖线虫病害典型症状识别法和室内线虫镜检法,将试验设定为水稻阴性组、假阴性组和阳性组等3个处理,通过对3个处理组测定其株高、穗头长度、穗粒数、结实数、千粒重及线虫载量等表型特征来分析水稻干尖线虫病为害情况。结果显示：与阴性组对照组相比,阳性组株高降幅为11.54%、穗头长度降幅为20.43%、穗头粒数降幅为44.13%、结实数降幅为48.41%,千粒重降幅为10.38%,阳性组稻穴发病率为47.63%。差异显著性分析显示,阳性组与阴性组、假阴性组仅在千粒重上差异显著,其它如株高、穗头长度、结实数等表型数据差异不显著。在被线虫侵染的稻株中,稻穗和叶片是线虫主要隐匿部位,穗头线虫载量最高,阳性组中穗部线虫载量高达26.20条·穗-1,茎秆中线虫载量低,达0.73条·株-1;阳性组叶片部位线虫载量与假阴性组对比在P<0.05水平上差异显著,而在穗头和茎秆部位线虫载量差异不显著。该研究为农业科技工作者重新认识、评估水稻...     

干尖线虫对水稻的危害规律分析及防治策略

水稻干尖线虫是典型的种传害虫。从种子萌发出苗到新种子形成整个生育过程的营养体、生殖体均可受害,导致幼穗、穗形,谷粒发育变形,形成缩颈穗、畸裂谷等异型穗粒。为有效防治该虫害,分析了干尖线虫对水稻的危害规律,并提出了相关防治策略,即选用无线虫危害的稻种作种、采用药剂浸种、加强田间适应性栽培等。     

水稻干尖线虫对水稻剑叶的危害及对生长和产量的影响

研究了水稻干尖线虫对水稻生长发育及产量的影响,系统地分析了干尖线虫对水稻剑叶、穗长、株高、结实率、千粒质量的影响程度。结果显示,水稻干尖线虫对水稻剑叶的危害程度可分为4级。由于水稻干尖线虫的危害,造成稻穗总粒数、结实率、千粒质量严重下降,致使产量损失10%~50%。研究可为农业生产中水稻干尖线虫病对水稻产量损失的测定提供依据。     

水稻干尖线虫不同接种方式对稻株发病率的影响及防治技术

分别采用浸种、浸芽、注芽3种处理方式,利用灰葡萄孢培养繁殖的水稻干尖线虫接种健康的水稻种子,对3种方式接种的水稻种子田间发病率进行调查,结果表明:在相同接种浓度和田间管理条件下,采用浸种方式接种水稻干尖线虫的种子发病,病株表现为典型干尖症状,而采用浸芽和注芽2种方式接种水稻干尖线虫的种子均不发病.浸种处理是防治水稻干尖线虫病最有效的方法.     

小麦抗赤霉病品种宁7840中抗病基因TaLRG的cDNA克隆和特性分析

为探索小麦NBS-LRR类抗病基因的克隆方法、功能及作用机制,从小麦抗赤霉病品种宁7840中通过RT-PCR和RACE技术(末端快速扩增技术)得到一个新的NBS-LRR类抗病基因同源序列,命名为TaLRG,开放阅读框3063bp,编码1021个氨基酸,具有NBS保守结构域和多个亮氨酸重复序列.聚类分析发现其编码蛋白质与...     

人工接种测定水稻干尖线虫在水稻上的病害发展动态

 【目的】探讨近年来江苏水稻生产上的重要病害水稻—“小穗头”和水稻干尖线虫间的相互关系。【方法】在水稻“小穗头”上分离出干尖线虫，经人工培养，在温室中接种到镇稻2号和武运粳7号的芽鞘部和叶鞘部，通过测定发病程度，稻谷饱满度，谷粒中线虫虫量和线虫死亡率等指标来确定对“小穗头”形成以及对水稻生长发育的影响。【结果】 镇稻2号“小穗头”与健康稻穗相比水稻株高下降6.7%、稻穗长度减少16.4%、稻谷粒数下降13.5%。在开花期之前，线虫主要分布于叶鞘部和生长点周围，虫量增加40%;花期后，线虫主要分布于稻穗上并且虫量增幅达90.8%。饱粒种子中带虫率、线虫虫量最高，空粒种子则最低。线虫死亡率在胚乳发育正常的种子中要比胚乳发育不正常的种子低。【结论】水稻干尖线虫是造成水稻“小穗头”症状的病原。武运粳7号仅表现“小穗头”而无叶片干尖症状，说明该现象是干尖线虫在水稻上呈现的新症状。     

贝西滑刃线虫糖苷水解酶16基因克隆及功能

为研究线虫寄生相关基因,基于贝西滑刃线虫转录组高通量测序数据,筛选并克隆了贝西滑刃线虫糖苷水解酶16基因,对该基因进行了功能分析;应用Mega 5.05选用WAG模型所构建的最大似然树进行分析比对;通过原位杂交,定位了糖苷水解酶16基因在线虫体内的表达部位,分析了糖苷水解酶蛋白的三维空间结构。结果表明:贝西滑刃线虫糖苷水解酶16基因与真菌亲缘关系近,是通过基因平移解说的一个重要佐证。     

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全长的克隆及序列分析

【目的】克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列,为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA序列设计兼并引物,用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列,再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,分别回收克隆的目的基因片段,再与pMD18-T载体连接,分别转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后进行拼接,获得巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。【结果】克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922bp,其中开放阅读框为1 452bp,共编码483个氨基酸;BLAST分析表明,巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53%和50%;氨基酸进化分析显示,巴什拜羊首先与绵羊聚为一类,其次与牛聚为一类,该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】通过RACE方法成功地克隆了1 922bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列,且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。     

叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中PR1基因的克隆及分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中获得1个病程相关蛋白1(Pathogenesis-related proteins 1,PR1)基因,暂命名为TcLr19PR1。该基因长度为810bp,包含495bp ORF区,编码164个氨基酸,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与多个植物病程相关蛋白1基因具有较高同源性。利用半定量分析表明,TcLr19PR1基因受叶锈菌诱导后表达量变化明显,非亲和组合表达高于亲和组合。Southern杂交验证说明TcLr19PR1在小麦基因组中为低拷贝。利用‘中国春’缺体-四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上,为进一步明确叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中病程相关蛋白1基因的抗叶锈相关性奠定了基础。     

黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。     

草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA end, RACE)技术获得草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因全长cDNA序列为2 093 bp,含有1个1 944 bp的开放阅读框,5′非编码区长25 bp,3′非编码区长124 bp,可编码647个氨基酸.生物信息学分析表明,在IAP的N端无氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是斑猫鲿;在系统进化上,与斑马鱼、斑猫鲿共聚为1支.用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因在不同组织中的表达分布,正常情况下,凋亡抑制蛋白基因在所取的7种组织中均有表达,其中脑、肠和肾表达最高,肝和心脏次之,鳃和肌肉最低,但差异不显著;用嗜水气单胞菌人工感染24 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均降低约26%,以肝脏和肌肉降低较为明显,在感染48 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均升高约4%,其中心脏、肝脏和鳃分别升高8%、16%、19%,这表明草鱼细胞凋亡抑制蛋白可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.     

兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP） 基因克隆及其同源性比较

【目的】克隆兰州大尾羊心脏型肪酸结合蛋白（H-FABP）基因全长cDNA序列,为研究绵羊H-FABP生物学作用和生产应用提供理论依据。【方法】根据已知哺乳动物H-FABP基因 cDNA 序列,设计5''和3''特异引物,运用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得兰州大尾羊H-FABP基因全长 cDNA 序列。【结果】 扩增获得兰州大尾羊5''端425 bp、3''端231 bp片段和 177 bp中间片段,拼接获得748 bp兰州大尾羊H-FABP基因全长cDNA 序列（GenBank登录号：JQ780322）。 兰州大尾羊H-FABP基因ORF长 402 bp,编码 133 个氨基酸。核苷酸序列分析显示兰州大尾羊H-FABP基因序列与大多数哺乳动物相似,但其第66位发生的碱基转换（T←→G）引起所编码的第22位天门冬氨酸（N）不同于其它所有物种的赖氨酸（K）。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与山羊亲缘关系最近。预测兰州大尾羊H-FABP蛋白质的空间结构与山羊和牛H-FABP类似,由2个α螺旋和10个反向平行的β折叠组成,10 个折叠片围成一个桶状结构,疏水性残基位于桶内,用于结合脂肪酸。【结论】克隆了兰州大尾羊H-FABP基因,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。