杨树维管组织特异启动子的克隆与启动活性分析

启动子在基因表达调控中起关键性作用,它在很大程度上决定所控基因表达的时间、空间和强度。依据拟南芥ATH1芯片分析杨树维管形成时期特异表达基因的结果,选取了差异表达基因NST3,通过BLAST比对在杨树EST数据库(PopulusDB)中找到同源性较高的基因NAC068。以毛白杨为材料,在其基因组中克隆得到该基因5'侧翼区901 bp长的片段,命名为pProNAC068,将该片段置换pBI121载体中的CaMV35S启动子,并在84K杨中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现:该启动子可以控制外源基因在次生维管组织中特异表达,从而为基因工程中有目的的控制外源基因在维管组织中的表达奠定基础。     

杨树皮储藏蛋白基因启动子的克隆和功能研究

杨树树皮储藏蛋白BSP是类似种子储藏蛋白的氮素储藏物 ,冬季在韧皮部薄壁细胞中大量积累 ,是落叶树氮代谢中的重要成分。为了研究BSP基因启动子在转基因植物中的表达特性 ,探索其在植物基因工程研究中潜在的应用价值 ,我们用PCR方法从美洲黑杨基因组中DNA扩增得到了BSA启动子片段。与GUS基因融合构建中间载体后 ,转化烟草 ,获得了一批PCR检测为阳性的转化再生植株。经GUS组织化学检测 ,发现若干转基因烟草的茎和叶柄韧皮部以及叶脉都呈GUS染色阳性 ,初步证明杨树BSP基因启动子确有韧皮部表达特性 ,可介导GUS基因在转基因烟草韧皮部特异表达。     

杨树类锌指基因ZFL的功能分析

以毛果杨叶片cDNA为模板,采用PCR技术分离出杨树ZFL基因,序列分析结果表明该基因序列开放读码框315 bp,共编码104个氨基酸,推导的蛋白质分子量为11.202 kDa,理论等电点9.83,命名为PtrZFL.对ZFL基因进行实时荧光定量PCR表达分析,结果表明:甘露醇、NaCl、H202、ABA、低温胁迫都能诱导PtrZFL基因的表达,且PtrZFL表达量在ABA处理3h时达到最高,然后随处理时间延长而逐渐降低;低温(4℃)胁迫在6h后能显著诱导PtrZFL基因表达,并随着低温处理能一直保持较高水平的表达.根据毛果杨基因组信息设计引物,获得了PtrZFL基因上游1000bp的启动子序列,序列分析结果表明该启动子包含有多个与胁迫相关的元件,如抗冻、缺水、抗寒、脱落酸响应元件ABRE、MYB和WRKY.GUS活性检测发现,该启动子在转基因拟南芥整株中都有表达,但在根部和成熟叶片中表达较强,其他位置表达微弱.     

毛竹PeAP2基因及其启动子的克隆与表达初步分析

APETALA2(AP2)基因在植物生长发育过程中发挥着重要作用.利用RT-PCR和RACE方法,从毛竹中克隆到1个AP2同源基因的全长cDNA序列,命名为PeAP2.序列分析表明:PeAP2基因全长1 750 bp,其中,5′端非编码区106bp,3′端非编码区174 bp,开放阅读框1 470 bp,编码1个489 aa的蛋白,该蛋白含有2个AP2结构域,属于AP2/EREBP家族的AP2亚家族.PeAP2蛋白与来自其它单子叶植物的AP2蛋白均有着较高同源性,其中,与二穗短柄草的AP2蛋白同源性最高,达74.85％.实时定量PCR分析显示:PeAP2基因在毛竹的根、茎、叶、鞘和节5种器官中均有表达,其中,叶片中的表达丰度最高,鞘中次之,而在根、茎、节中的表达丰度接近,均较低.利用hiTAIL-PCR方法克隆获得了PeAP2上游启动子区序列1 359 bp,分析显示其含有光、激素等多种信号应答相关的作用元件.     

种子胚特异性启动子的克隆及其功能验证

以水稻品种日本晴DNA为模板,用PCR的方法从水稻胚特异性表达基因OsESG上游序列扩增出特异性条带,克隆出种子胚特异性启动子,长度为1.1kb,且已知的功能部位序列没有发生改变。用它构建了带动报告基因GUS表达的双元载体,并用农杆菌介导法转化水稻得到了转基因植株。对GUS基因的表达检测表明,由该启动子序列引导的GUS基因仅在胚中特异性表达,而其它组织中都未表达,证实该启动子具有胚特异性表达的功能。     

杨树因伤诱导型启动子的克隆及功能分析

机械损伤或病虫害侵扰引起植物一系列防御相关基因的激活,其中一些是因伤诱导表达的．Ｂｒａｄｓｈａｗ等１９８９年报道了杨树Ｗｉｎ３基因家族中的一员,其编码产物类似于白薯和豆类胰蛋白酶抑制剂,并且是因伤诱导表达的。为了更全面的了解这一基因启动子在因伤介导表达中的作用,探讨其在基因工程用于控制外源基因表达的可能性,本文分别从欧洲黑杨（Ｐ．ｎｉｇｒａ）和美洲黑杨（Ｐ．ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）中扩增出ｗｉｎ３基因启动子ＷＩＮＰ（７０５ｂｐ）和ＷＩＤＰ（７９１ｂｐ）．这两个启动子与来自大肠杆菌的ＧＵＳ基因融合,通过根癌农杆菌Ｔｉ质粒转化系统引入烟草中．证实了ＷＩＮＰ和ＷＩＤＰ控制的ＧＵＳ基因的表达不仅在损伤部位,而且具有系统的因伤诱导效应．对８株转基因烟草的组织化学分析表明,其表达模式与以前的报道一致。无论是在受损伤组织还是完整组织中,ＷＩＮＰ的伤诱导活性总比ＷＩＤＰ高。这两个启动子需要进一步改造以增强其活性。     

黑杨三倍体 PtSIP3基因的克隆与功能分析

本研究以黑杨中林46三倍体为材料,依据前期表达谱芯片的分析结果,分离克隆得到三倍体材料中高表达基因PtSIP3,该基因的编码产物为钙调磷酸酶B(Calcineurin B-like Proteins,简称CBL)的靶蛋白。随后构建了双元表达载体pRI101-PtSIP3,并成功的转入拟南芥中。经qRT-PCR表达分析和表型观察,发现PtSIP3 在拟南芥中异源过表达会抑制胚和果荚的发育、促进根的快速伸长。推测该基因在黑杨三倍体中的表达升高,可能会参与黑杨三倍体的营养生长期的调控并促进根的发育。     

杨树基因启动子的克隆及功能研究进展

启动子是基因调控的重要元件,研究启动子的功能对于基因的表达调控有重要意义。本文从杨树启动子的克隆方法入手,着重介绍了杨树启动子的功能研究进展,并展望了今后的研究前景。     

马尾松PmPIN1基因的克隆及功能分析

【目的】PIN1基因通过调控生长素极性运输的方式在植物根系生长发育中发挥作用。对马尾松PmPIN1基因进行全长克隆和功能分析,有助于在分子水平揭示马尾松的生根机制。【方法】运用PCR和RACE技术成功克隆马尾松PmPIN1基因cDNA序列;利用生物信息学软件分析PmPIN1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;通过实时荧光定量分析PmPIN1基因在10年生马尾松幼根、1年生枝条、新叶、花中的表达量差异;利用农杆菌侵染法将PmPIN1基因转入烟草获得转基因植株,比较转基因烟草与转pCAMBIA-1302空白载体烟草之间的表型差异;用激光共聚焦显微镜观察PmPIN1-GFP荧光蛋白在转基因烟草根中的表达模式;酶联免疫法测定野生型和转基因烟草的根、根茎结合处及叶中的生长素含量;用不同浓度的生长素极性运输抑制剂1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)处理野生型与转基因烟草,分析烟草根、根茎结合处、叶中的生长素含量变化;利用PEG介导法将16318-hGFP-PmPIN1重组载体转化至拟南芥原生质体中进行亚细胞定位分析。【结果】PmPIN1基因全长2914bp,包含2085bp的ORF,编码的蛋白由695个氨基酸组成,N端与C端均有膜运输蛋白。系统进化树显示马尾松与油松在发育树同一支上。通过实时荧光定量发现PmPIN1在不同组织中的表达量差异达到极显著,1年生枝条与幼根中表达量较高,花中最低。农杆菌介导法转化烟草获得的转基因烟草,较转空载烟草株高增长,生根量增加且根系变长。激光共聚焦显微镜观察得出转基因烟草根部中间有明显绿色荧光富集现象。酶联免疫法测定结果表明转基因烟草根、根茎结合处生长素含量高于野生型,且叶较根和根茎结合处减少。不同浓度NPA处理后,野生型烟草根中生长素含量变化达极显著,且生长素含量随NPA处理浓度的增加而减少;处理浓度为10nmol·L~(-1)时,叶中生长素含量最高;处理浓度为2nmol·L~(-1)时,根茎结合处生长素含量增加较多。不同浓度NPA处理后,转基因烟草不同部位生长素含量变化均未达到极显著。亚细胞定位分析表明PmPIN1蛋白主要分布于细胞膜上。【结论】马尾松PmPIN1与油松PIN1亲缘关系最近。PmPIN1属于膜蛋白。PmPIN1转基因烟草可能提高生长素由地上部位向地下部位的运输能力,减少NPA对生长素含量变化的影响,表明PmPIN1可能调控生长素的极性运输;PmPIN1-GFP绿色荧光富集在根部中间部位,PmPIN1在幼根中表达量较高,转基因烟草较转空载植株发根量多,根长长。研究结果表明PmPIN1基因可能在根系发育中发挥重要作用。     

杨树生物钟节律基因PtCCA1的克隆及表达模式研究

生物钟节律基因CCA1在植物的光周期反应中起着重要的调控作用.利用RT-PCR方法克隆获得了一条包含1902 bp开放阅读框的杨树CCA1基因cDNA序列,其编码633个氨基酸残基,蛋白的分子量约为68.90 kDa,等电点为6.33.分析显示含有1个Myb-like DNA结合域及2个蛋白跨膜结合域.实时荧光定量PCR分析发现,PtCCA1基因主要在杨树叶组织中表达;随着光照时间的变化,该基因在杨树中的表达量呈现白昼不断降低而夜晚逐渐升高的昼夜变化趋势.研究结果为进一步探索PtCCA1基因在调控杨树光周期响应途径中的功能以及杨树光周期敏感机制提供了科学基础.     

重瓣山茶花器官发育相关基因CjAPL1的全长克隆与表达分析

为研究A功能基因在山茶花重瓣形成过程中所发挥的功能,利用同源克隆和RACE扩增方法,从重瓣山茶花品种‘金盘荔枝’发育早期的花芽中获得了山茶花AP基因全长cDNA,命名为CjAPL1,GenBank登录号JX657332。该基因全长1 149 bp,其中,开放阅读框(ORF)长度为741 bp,5’非编码区长度206 bp,3’非编码区长度202 bp。经氨基酸序列分析表明:CjAPL1基因编码一条含有246个氨基酸的蛋白质,与猕猴桃、八仙花等植物的Ap1蛋白同源性均在75%以上。Rea-time PCR结果显示,CjAPL1基因在‘金盘荔枝’不同发育时期花芽中的表达量为:花芽发育早III期>花芽发育早II期>花芽发育早I期>现蕾期,表达趋势表现为先逐渐升高而后急剧降低;花器官不同部位中的表达量为花柱最高,其次为子房和萼片,在雄蕊下部和外轮花上部中的表达量最低。这些差异表明,CjAPL1基因可能在‘金盘荔枝’重瓣花形成中发挥作用。     

银杏过氧化氢酶基因CAT1的克隆及表达分析

利用RACE技术从银杏中克隆到过氧化氢酶基因(GbCAT1)的cDNA全长。进化树分析结果表明:GbCAT1和其他物种的CAT源自于相同的祖先。Southern杂交显示:GbCAT1属于1个小的多基因家族。实时定量RT-PCR分析表明:GbCAT1在银杏的根、茎、叶和果中都有表达,在叶中的相对表达量最高,其次为果、茎和根。GbCAT1的转录受到ABA、渗透压、紫外、低温和高温胁迫的诱导。水杨酸处理下,GbCAT1相对表达量迅速降低。CAT1基因在逆境条件下的相对表达变化与环境胁迫有关。     

杜仲1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因cDNA全长克隆与序列分析

以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出DXR基因cDNA全长。序列分析结果表明该基因序列全长1 814 bp,共编码478个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.71 kD,理论等电点5.79,命名为EuDXR。推导的EuDXR蛋白质序列具有植物DXR酶的5个典型基序,并预测出26个潜在的功能位点。系统进化树分析表明EuDXR蛋白与玉米、水稻亲缘关系最近,其次为橡胶、拟南芥、烟草。     

杜鹃红山茶CaAPX基因的克隆、表达及功能分析

[目的]利用分子生物学技术探讨杜鹃红山茶CaAPX基因的表达模式及在模式植物烟草中所起的抗寒、耐热作用,为今后山茶花抗逆育种奠定基础。[方法]根据山茶花同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3’,5’-RACE技术,从杜鹃红山茶嫩叶组织中克隆出抗坏血酸过氧化物酶(APX),命名为CaAPX,基因全长1 097 bp,开放阅读框753 bp,编码250个氨基酸。实时荧光定量PCR对杜鹃红山茶7种组织和温度胁迫下该基因的表达模式进行分析。[结果]表明:CaAPX基因在杜鹃红山茶7种组织中均得到表达,但表达水平不一,表达量由高到低依次为:未成熟果实嫩叶花苞叶芽种胚花瓣花芽,其中,未成熟果实中的表达量是其它组织的2.6811.44倍;温度胁迫处理8 h后该基因呈上调表达,CaAPX基因表达量分别是0 h的3.49和2.67倍。CaAPX基因转化烟草分析表明,过量表达CaAPX基因后,APX活性提高了2.58 4.09倍,抗坏血酸(As A)含量提高了2.673.56倍,并且转基因烟草植株的抗寒、耐热能力也获得提高。[结论]通过过量表达CaAPX基因能够提高烟草植株的抗寒、耐热性,为山茶花抗逆育种提供了科学依据。     

麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶em>pepc基因全长cDNA克隆及序列分析

应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C₃型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。     

赤桉GAPDH家族基因的克隆及其序列分析

GAPDH is a typical structural protein in eukaryote organism, which plays an important role involved in the biosynthesis of cell composition and the expression of genetic information. In order to reveal the biological function of GAPDH in the growth and development of Eucalyptus, 3 genes were obtained and named as EC-GAP1, EC-GAP2 and EC-GAP3 by amplification with primers for GAPDH genes conserved regions and RACE method from the young leaf of Eucalyptus camaldulensis. The bioinformatics analysis suggested that the proteins encoded by corresponding genes owned the typical conserved domains of GAPDH and showed high homology with those of other plant species.