棉花arf1启动子驱动Cry1A基因在烟草中特异性表达研究

在新一代Bt作物以及Bt作物安全性研究方面, Bt毒蛋白在植物特定发育阶段的表达特性渐受关注。本研究构建了植物表达载体pGBI121.A1Bt, 其携带棉花arf1启动子驱动Cry1A基因的表达盒, 启动子后面有一个Ω序列; 对照载体pGBI121.4AB携带P2E35S启动子(增强子加倍的修饰CaMV 35S启动子)驱动Cry1A基因的表达盒, 在启动子后面也有一个Ω序列。利用根癌农杆菌介导法, 将植物表达载体pGBI121.4AB和pGBI121.A1Bt转化烟草, 分别获得44株和42株转基因烟草再生植株。ELISA检测表明, 在pGBI121.A1Bt转基因烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶中Cry1A基因的平均表达水平分别为pGBI121.4AB的1.5、1.5、1.4和0.3倍。棉花arf1启动子在烟草中表达, 证明了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性, 为arf1启动子应用于转基因抗虫棉, 在棉花蕾铃中优势表达Bt毒蛋白, 提高转基因棉花蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究提供了依据。     

野生茄托鲁巴姆抗根结线虫相关基因的克隆与表达分析

克隆茄子抗根结线虫相关基因并利用荧光定量PCR技术分析其表达特性。根据在NCBI上找到的抗性基因NBS-LRR保守结构域,设计简并引物,以野生茄托鲁巴姆(Solanum torvum Swartz)的c DNA为模板采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆抗根结线虫基因,利用荧光定量PCR技术分析其表达特性。获得15条抗性基因片段,且E1、E3、E6、E7、E12、E13、E15为茄子抗根结线虫基因片段。通过聚类分析和氨基酸比对确定E7为Mi基因的一部分。利用RACE技术获得到了野生茄托鲁巴姆抗根结线虫Mi同源基因序列。本研究在野生茄托鲁巴姆中获得了抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs)基因,为茄子抗根结线虫分子育种奠定基础。     

棉花arf1启动子驱动Cry1A基因在烟草中特异性表达研究

在新一代Bt作物以及Bt作物安全性研究方面, Bt毒蛋白在植物特定发育阶段的表达特性渐受关注。本研究构建了植物表达载体pGBI121.A1Bt, 其携带棉花arf1启动子驱动Cry1A基因的表达盒, 启动子后面有一个Ω序列; 对照载体pGBI121.4AB携带P2E35S启动子(增强子加倍的修饰CaMV 35S启动子)驱动Cry1A基因的表达盒, 在启动子后面也有一个Ω序列。利用根癌农杆菌介导法, 将植物表达载体pGBI121.4AB和pGBI121.A1Bt转化烟草, 分别获得44株和42株转基因烟草再生植株。ELISA检测表明, 在pGBI121.A1Bt转基因烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶中Cry1A基因的平均表达水平分别为pGBI121.4AB的1.5、1.5、1.4和0.3倍。棉花arf1启动子在烟草中表达, 证明了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性, 为arf1启动子应用于转基因抗虫棉, 在棉花蕾铃中优势表达Bt毒蛋白, 提高转基因棉花蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究提供了依据。     

拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQ MT）启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7~10.9倍。结果表明MPBQ MT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

“一种根结线虫分子鉴定引物集及其制备方法与应用”发明专利获公开

<正>据悉,近日国家知识产权局公开一件由中国农业科学院烟草研究所申请的发明专利:一种根结线虫分子鉴定引物集及其制备方法与应用。该发明提供了一种根结线虫分子鉴定引物集,通过如下方法获得:利用预测的南方根结线虫蛋白序列分别与南方根结线虫基因组和北方根结线虫基因组比对,设置比对序列的相似度即percent参数为75,得到单拷贝基因;将单拷贝基     

角瓜与南方根结线虫非亲和互作相关MicroRNAs的鉴定

为鉴定角瓜与南方根结线虫非亲和互作中的植物源MicroRNAs(miRNAs),预测miRNAs的靶基因,解析miRNAs的表达模式.构建角瓜与南方根结线虫亲和、非亲和互作的小RNA(sRNA)文库,通过Solexa测序和生物信息学分析筛选鉴定角瓜与南方根结线虫非亲和互作相关的miRNAs,利用PsRNATarget软件预测miRNAs的靶基因,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对测序获得的miRNAs进行表达验证.结果表明,18份样品测序获得的Unique reads数量在808262～3926308条,长度24 nt的sRNA丰度最高,miRNAs占sRNA的0.3％～0.5％,包含565个已知miRNAs,归属75个miRNAs家族,其中miR156包含的家族成员数目最多.26条差异表达的miRNAs响应南方根结线虫胁迫的表达模式分为4种类型,其中10条显著差异表达的角瓜miRNAs与南方根结线虫非亲和互作密切相关.miRNAs靶基因预测显示,一个miRNA可调控多个靶基因,同一miRNA的靶基因同源性较高,miRNAs靶基因功能主要涉及转录激活,参与植物生长发育和调控,以及编码信号传导和细胞代谢相关蛋白等.这些研究结果为探明角瓜与根结线虫非亲和互作的miRNAs调控机理奠定了基础.     

重组des-pGlu1-Brazzein基因植物表达载体的构建及对人参果的遗传转化

本研究通过对茄科植物的E8基因的非编码区DNA序列进行亲缘关系及功能元件保守性分析,发现E8基因的非编码区包含ERE,茉莉酸和低温干旱应答等基序并存在较高的保守性,表明利用果实特异性E8启动子改善同属茄科茄属的人参果果实风味更具特异性;利用密码子偏爱性优化设计甜蛋白Brazzein,采用亚克隆技术成功获得甜蛋白des-pGlu1-Brazzein基因和E8启动子基因,经Blast对比均与GenBank中已报道的序列高度同源,并利用2KGQ模型分析des-pGlu1-Brazzein基因的空间结构特性;以中间载体pHANNIBAL及植物表达载体pCEPSP为基础,分别构建由E8启动子及35S启动子驱动的兼具重组甜蛋白及除草剂抗性的植物表达载体,并通过农杆菌介导法进行人参果的遗传转化,获得转化再生植株54株,经检测从中筛选出15株阳性植株,初步确定已经完成目的基因整合到人参果基因组中。     

大豆GmMYB12B2植物表达载体的构建及转化烟草

为研究大豆MYB转录因子-GmMYB12B2在转基因植物类黄酮代谢中的作用,利用吉林大学植物种质资源与利用研究室前期克隆的GmMYB12B2基因,以PPZP质粒为表达载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动GmMYB12B2基因的植物表达载体PPZP-GmMYB12B2;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行遗传转化。经PCR随机扩增鉴定9株转基因烟草,其中有6株是阳性植株,初步证明已获得转大豆GmMYB12B2基因的烟草。     

文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

大蒜抗根结线虫内生细菌的筛选及盆栽防效试验

利用稀释涂布平板法,从受根结线虫为害的大蒜根须组织研磨液中筛选对根结线虫有明显抑杀效果的内生生防细菌。结果表明,在盆栽试验中,菌株S1-1对根结线法的杀线虫由活性为90.8%。通过盆栽试验验证生防菌株的防效,菌株S1-1防效为74.86%。结合菌株形态特征、分子生物学和生理生化特性,将菌株S1-1鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。     

猪屎豆与淡紫拟青霉联合防治烟草根结线虫病的效果评价

为明确猪屎豆与淡紫拟青霉对烟草根结线虫病的联合作用,以猪屎豆根系粉为材料,研究了猪屎豆根系水提液对淡紫拟青霉的生长、产孢量、孢子萌发率及南方根结线虫致死率的影响,同时设置3个处理（单独间作猪屎豆、单独施用淡紫拟青霉、间作猪屎豆同时施用淡紫拟青霉）对猪屎豆与淡紫拟青霉联合防治烟草根结线虫病的协同增效效应进行了综合评价。结果表明：（1）猪屎豆根系粉适能促进紫拟青霉的生长、产孢及萌发,0.01 g/mL猪屎豆根系粉的淡紫拟青霉培养物的水提液处理南方根结线虫J2,24 h校正致死率高达96.08%。（2）烤烟间作猪屎豆同时施用淡紫拟青霉,能显著增加烤烟的株高和叶片宽度,烟草根结线虫病的防效高达67.5%,较单独间作猪屎豆的防效提高了22.9%,较单独使用淡紫拟青霉的防效提高了10.2%。本研究认为猪屎豆与淡紫拟青霉协同作用防治烟草根结线虫具有显著的协同增效效应。     

盆栽榕树主要根结线虫的发生及其生物防控技术研究

盆栽榕树是福建省主要出口创汇植物产品,近年受根结线虫为害严重。笔者介绍南方根结线虫和花生根结线虫在盆栽榕树上的发生情况,并从抗性品种选育、天敌生物利用和植物源杀线剂研发等方面,解析盆栽榕树主要根结线虫的生物防控技术,以期实现对根结线虫的无公害与可持续控制。     

南方根结线虫不同密度对番茄生长的影响

南方根结线虫病(Meloidogyne incognita)是番茄生产上的主要病害。为明确土壤中南方根结线虫初始密度与番茄产量损失的关系,在温室条件下,通过盆栽试验,测试土壤中根结线虫不同初始密度对番茄不同生长期株高和生物量等方面的影响。结果显示,番茄植株的长势随接种密度的增加而减弱,即随着接种密度的增加,植株高度降低,叶片数和花穗数减少,鲜重与干重显著减轻,番茄的发病程度则逐渐加重。利用Seinhorst模型,分别以株高、鲜重、干重为指标确定了番茄对根结线虫的最低忍耐值T;综合本研究结果,确定番茄对根结线虫的最低忍耐值为4.4头/(mL·土),低于该密度线虫虽对番茄根部造成一定危害,但对植株地上部的生长影响不明显。     

番茄品种对南方根结线虫的抗性鉴定

为了明确番茄品种对南方根据线虫的抗性情况,采用温室内盆栽番茄人工接种法, 鉴定了江苏及周边地区栽培的17个番茄品种对南方根结线虫 (Meloidogyne incognita) 的抗性程度。结果表明,天宝316表现高抗;以色列A316和粉果310表现中抗;秦樱3号、布鲁诺以及瑞星华美表现出抗病;奥米多9号、欧亚奇以及美国903表现出感病性;苏红2003、美国大红、合作903、台湾圣女、多彩水果番茄、奥利、黄贵妃樱桃番茄以及荷兰紫圣果表现出高感病性。携带Mi基因的番茄品种能够对南方根结线虫具有很好抗性,笔者利用引物SCAR F及SCAR R进行特异性检测发现,天宝(KF015736)、瑞星华美(KF015735)及多彩水果(KF015734)均获得720bp条带,与Heinz 1706（DQ437766）Mi基因同源性达到100%。     

陕西设施蔬菜根结线虫特异性分子检测

为明确陕西设施蔬菜根结线虫的主要种类,利用已报道的花生根结线虫[Meloidogyne arenaria (Neal.) Chitwood]、南方根结线虫[Meloidogyne incognita (Kofold & White) Chitwood]、北方根结线虫(Meloidogyne hapla Chitwood)和爪哇根结线虫[Meloidogyne javanica (Treub)]的特异性引物,对陕西省20个县市区的24个样区的根结线虫进行PCR检测。样品中检测到了南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫,其中南方根结线虫为优势种群,大部分样区为单一种群为害,但个别样区存在2种种群。     

水稻、拟南芥组织特异性启动子的序列特征分析

本文以UniGene 数据库中有关拟南芥和水稻的相关信息,分别获得根、叶片、花、种子4种组织中特异表达基因和特异不表达基因。在TAIR和RAP-DB下载获得此类基因启动子序列,利用生物信息学软件MEME对组织特异表达基因启动子序列进行分析,预测得到组织特异表达基因的顺式作用元件。又利用模式搜索软件FIMO,考察每一条顺式作用元件在这种组织特异表达基因和组织特异不表达基因启动子序列中的分布特征,其中“CCACACA”极有可能为控制基因在拟南芥叶片中表达的顺式作用元件。本研究技术和策略为理解基因表达调控的机制提供参考依据。     

拟南芥DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建

以拟南芥幼苗总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到DREB2A基因,并将其克隆到植物表达载体pCAM-BIA1304中CaMV 35 S启动子与poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304-DREB2A。另外,获得了携带DREB2A基因的根瘤农杆菌菌株,为以后转基因植物工作奠定了基础。     

Sr18生物杀线虫制剂防治黄瓜根结线虫病研究

利用生防菌株Sr18研制的生物杀线虫剂,于2003—2004年在山东省济南的日光节能温室内进行了防治黄瓜根结线虫病的研究。结果表明,通过发酵工程及生化分离手段制得的生物杀线剂1,2,3号均有显著的抗线虫括性,其中以2号浓缩水剂效果最为显著,可明显降低土壤内根结线虫2龄幼虫的数量,虫口减退率94．68％,收获期对黄瓜根结线虫病的防效高达80．27％,显著高于对照化学药剂益舒丰（65．84％）和生物药剂灭虫灵（52．44％）。另外,该制剂还具有促进植株生长和提高产量的效果,杀线剂2号处理区的平均株高和单株鲜重极显著高于空白对照组,分别增长16．32％和20．43％;杀线剂2号的黄瓜增产率为28．28％,优于益舒丰（19．8％）和灭虫灵（17．43％）处理。     

INO启动子克隆及胚珠特异表达载体的构建

为了观察转基因植株胚珠特异性表达,采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体并对番茄进行遗传转化。根据已报道的INO启动子序列设计并合成一对特异引物,通过PCR对启动子进行扩增、连接并对其进行测序,结果表明：与GenBank中已注册的INO启动子序列的同源性为100%,并且构建了以INO代替CAMV35S启动子的pCAMBIA1304-L117植物表达载体,采用冷冻法将其转入根癌农杆菌EHA105。成功构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体,并为进一步检测奠定了基础。