8株嗜温气单胞菌的外膜蛋白型及其聚类分析

从送检病鳖、病鱼体内分离出 8株细菌 ,经形态学、生理生化特性、致病性和血清学鉴定 ,确定 3株 (BA1、BA3、BA6 )为嗜水气单胞菌 ,5株 (M1、BA 1 6、BA1 5、BA 1 0、XA2 3 )为温和气单胞菌。采用超声波破碎 - SI法提取其外膜蛋白(OMPs) ,进行 SDS- PAGE电泳 ,聚类分析 OMP型。结果表明 ,8株嗜温气单胞菌具有不同的 OMP型 ,与菌株来源、致病性及地域分布有关。 3株鳖源致病性温和气单胞菌 (BA1 6、BA1 5、BA1 0 )属同一 OMP型 ,鱼源非致病株 (M1 )与致病株 (XA2 3 )在 3 .2× 1 0 4 ～ 3 .5× 1 0 4 间有明显差异 ,鳖源非致病性嗜水气单胞菌 (BA6 )与致病株 (BA1、BA3 )的 OMP型相似 ,但蛋白带的迁移率及颜色深浅在菌株间仍有差异。根据 OMPs条带迁移率 ,通过类平均法对 8株嗜温气单胞菌进行系统聚类分析 ,结果显示了不同菌株间在分类学上的远近     

林蛙嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆、分析及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,采用PCR方法,扩增出与预期设计的740 bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果表明,所克隆的目的基因的核苷酸长为740 bp,共编码246个氨基酸.该基因片段与已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白基因核苷酸序列同源性为98.78%,氨基酸同源性为98.78%.利用生物信息学和分子生物学软件,对嗜水气单胞菌外膜蛋白的结构进行预测,结果表明其为外膜孔蛋白.本试验为嗜水气单胞菌外膜蛋白的表达及基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

温度对嗜水气单胞菌外膜蛋白表达的影响

提取嗜水气单胞菌J-1、Y-1、F-155 株的外膜蛋白(OMP)作SDS-PAGE,结果显示,它们的电泳图谱属于同一模式,均含有22 000、31 000、38 000、43 000 和50 000 等5 条主要OMP带。温度影响嗜水气单胞菌OMP的表达,28℃培养时表达的OMP以43 000 者为最多;而37℃培养时表达最多的是38 000 的条带。J-1株37℃培养时对鲫鱼和小鼠的LD50分别为3.4×106、2.5×106 CFU;28℃时则为8.7×105、1.8×105 CFU,表明28℃培养时J-1 株毒力较强。随着OMP在载样缓冲液中煮沸时间的增加,主要蛋白带的浓度降低,相对分子质量小的蛋白带增多。免疫转印显示,这些蛋白带均能与J-1 株OMP多抗呈显色反应。抗原性分析表明,J-1 株OMP与HEC毒素之间无抗原性交叉。     

嗜水气单胞菌J-1株外膜蛋白Omp38的抗原性分析

根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白Omp38的基因序列设计引物,以Ah J-1株基因组为模板,扩增omp38基因片段,定向克隆至表达质粒pET32 a中,将重组原核表达质粒pET32 a-omp38转化至大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量约35 ku的重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA检测抗体效价为1∶25 600,表明该蛋白有良好的免疫原性。PCR检测表明,omp38基因可在73%(22/30)的嗜水气单胞菌中发现。重组蛋白抗血清与30株嗜水气单胞菌分离株进行凝集试验,所有分离株均可在不同程度上发生反应,表明该重组蛋白是一种潜在的共同保护性抗原,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定

从陕西省甘养殖场送检的病鱼中分离到1株革兰氏阴性杆菌，培养特征观察笔生化特性分析结果证实为嗜水气单胞菌；小鼠和金鱼致病性试验证实分离菌具有致病性；药敏试验结果表明该菌对链毒素、万古霉素等高度敏感，对羧苄青霉素、氟哌酸等不敏感。用该菌制成灭活免疫金鱼保护力可达到80％以上。     

甲鱼嗜了单胞菌的分离定与鉴定

从广西凭祥市浦寨边贸点截获偷运入境的东南亚某国甲鱼发现以甲部出血糜烂，继而脱落而呈火山口样病变，经实验实检验分离出一株细菌，生理生化符合气单胞菌特性，能发酵葡萄糖，产酸产气并水解七叶苷，定为嗜水气单胞菌。该菌株能在24小时内对小白鼠致死，将该菌回归甲鱼可复制出类似于上述病变的疾病，该菌对氯霉素，痢特灵等多种抗生素敏感。     

嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AopN蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank上登陆的嗜水气单胞菌AH-1株Ⅲ型分泌系统aopN基因序列,设计1对特异性引物,以J-1株的基因组为模板,PCR扩增得到aopN基因,连入pET-32a(+),转化至大肠杆菌表达,同时PCR检测aopN基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。aopN基因测序分析发现,片段长度为874 bp,与嗜水气单胞菌AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97%、81%、82%,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为81%,与温和气单胞菌的同源性为82%。PCR检测结果表明,57株能检测到aopN基因的目的片段。SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量为54.5ku,用兔抗J-1株的全菌抗血清进行Western blot分析表明,该蛋白具有较好的免疫反应性。由于多数菌株都含有aopN基因,提示AopN可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。     

团头鲂对3种致病菌外膜蛋白(OMP)的免疫应答

利用从柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和温和气单胞菌(Aeromonas sobria)中提取的外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)作为免疫原,注射接种团头鲂(Megalobrama amblycephala)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、肾脏和血液中吞噬细胞的吞噬活性和采用A.hydrophila活菌攻毒方法,比较了3种致病菌OMP对团头鲂的免疫原性。试验结果表明,从3种致病菌中提取的OMP对团头鲂均具有较强的免疫原性,受免鱼的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鱼相比,肾脏和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A.hy-drophila活菌攻毒的相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)明显上升。说明在3种致病菌的OMP上不同程度地存在共同保护性抗原。     

气单胞菌外膜蛋白基因工程疫苗的研究进展

就气单胞菌外膜蛋白的基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗、重组活载体疫苗等基因工程疫苗的研究现状、免疫方式以及不足之处进行了综述,以期为气单胞菌疫苗研制提供参考。     

两株气单胞菌的分离与鉴定

从福建省某牛蛙养殖场病死牛蛙和某鸭场病死鸭体内分离到两株细菌，检验结果表明，两株分离菌均为有运动力的革兰氏阴性杆菌。根据其临床症状、细菌培养特性、生化特性、动物回归试验以及溶血试验等一系列试验，研究证明牛蛙感染的病原为嗜水气单胞菌，鸭感染的病原为温和气单胞菌。     

布鲁氏菌外膜蛋白OMP15.6表达及免疫反应原性测定

表达羊布鲁氏菌16M预测外膜蛋白OMP15.6,探索其作为诊断抗原的可能性。采用降落PCR方法,从羊布鲁氏菌16M基因组DNA中扩增出423bp的基因片段,将该片段克隆于原核表达载体PGEX-4T-2,构建重组表达载体。经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,结果表明,在大肠杆菌中成功表达了外膜蛋白OMP15.6。经West-ern-blotting检测,该蛋白能与豚鼠抗布鲁氏菌阳性血清发生特异性免疫反应,为其之后的抗原性以及免疫原性研究奠定了良好的基础。     

嗜水气单胞菌的分离培养和鉴定

本研究对嗜水气单胞菌进行了分离鉴定,经过临床诊断和病理剖检发现患病鲫鱼具有典型的嗜水气单胞菌感染症状。镜下检查看到可见G-短小杆菌,呈单双排列,两端钝圆。分离培养得到圆形、圆滑、湿润边缘整齐、微凸、半透明、灰白色至淡黄色中等大小的菌落,生化试验结果显示发酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷和水杨苷。鉴定此细菌为嗜水气单胞菌。动物易感试验结果与结论相符。     

罗非鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定

北京某鱼场饲养的罗非鱼陆续发病死亡,其体表鳞片局部出血,肝、胰、脾脏肿大坏死,肠腔积水等,从病死及濒死罗非鱼的肝、胰脏中分离到 ４ 株细菌,经形态学、生理生化特性及血清凝集试验,鉴定为嗜水气单胞菌。４ 株细菌均能致死小鼠和鲢鱼。药敏试验表明,４ 株细菌对环丙沙星、蒽诺沙星高度敏感,而对青霉素和红霉素不敏感。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2的提取及鉴定

为简化副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2（OmpP2）的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型（SW114）、5型（Nagasaki）菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完整外膜,然后利用含有2% tritonX-100缓冲液对外膜进行进一步解离,最后利用适量浓度的胰酶对强疏水蛋白进行酶解,实现了Hps高纯度OmpP2的体外快速提取。SDS-PAGE结果显示,上述2株菌OmpP2大小分别约为43和38 ku;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）鉴定结果显示,从上述蛋白酶解下来的肽段经比对与Hps的OmpP2完全吻合。斑点杂交（Dot-blot）显示采自Hps患病猪血清在点有5型菌株（Nagasaki）OmpP2和点有3型菌株（SW114）OmpP2 NC膜上均发生杂交显色反应,该结果暗示OmpP2是一个具有免疫活性的抗原。本研究为OmpP2功能及免疫保护性研究奠定了基础,也为副猪嗜血杆菌病免疫学诊断提供新的参考。     

嗜水气单胞菌体外粘附Caco-2细胞对细胞膜生物学特性的影响

采用Caco-2细胞培养模型，研究了嗜水气单胞菌粘附Caco-2肠上皮细胞后时其活力、细胞膜磷脂酶A2（PLA2）、胞浆游离钙浓度、膜通透性和膜流动性的影响。结果显示，细菌粘附后1h，肠上皮细胞活力显著下降，PLA2活性和胞浆游离钙浓度显著增加，细胞外LDH含量和细胞损伤率显著升高（膜通透性异常增加），肠上皮细胞膜荧光，偏振度、膜脂微粘度显著增加（膜流动性降低），且上述指标均随着粘附时间的延长而持续升高或降低。     

禽病原性大肠杆菌6种血清型分离株外膜蛋白型的研究

从病鸡中分离的６ 种血清型（ Ｏ２、 Ｏ４６、 Ｏ１８、 Ｏ１２１、 Ｏ７６、 Ｏ１３１）及５ 种标准血清型（ Ｏ１、 Ｏ１５、 Ｏ３５、 Ｏ３６、 Ｏ７８）大肠杆菌中提取外膜蛋白（ Ｏｕｔｅｒ ｍ ｅｍ ｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）,经 Ｓ Ｄ Ｓ－ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析表明,分离株 Ｏ７６、 Ｏ１３１及标准株 Ｏ１、 Ｏ３５的外膜蛋白型由２ 条带组成,为 Ｏ Ｍ Ｐ－ １ 型;分离株 Ｏ２、 Ｏ４６、 Ｏ１８、 Ｏ１２１和标准株 Ｏ１５、 Ｏ３６、 Ｏ７８的外膜蛋白型由３ 条带组成,为 Ｏ Ｍ Ｐ－ ２ 型,结果表明,不同血清型菌株之间有相同的 Ｏ Ｍ Ｐ型。