番茄SlSPS1基因的克隆及表达分析

蔗糖是植物光合作用的主要产物,参与植物的多种生理生化反应.蔗糖磷酸合成酶是蔗糖进入各种代谢途径所必需的关键限速酶之一,其活性直接反映了植物体内蔗糖合成的能力.为研究番茄中蔗糖合成的作用机理,本研究从番茄果肉中克隆到一个蔗糖磷酸合成酶基因,并命名为SlSPS1,通过生物信息学分析发现其cDNA全长3488 bp,编码10...     

慈竹BeCesA1和BeCesA7基因的克隆及组织表达分析

植物的纤维素合成酶(CesA)是纤维素合成途径的关键酶,不仅与纤维素含量相关,也与植物生长发育相关。但有关慈竹CesA基因的克隆与分析,以及GA3对慈竹CesA基因表达的影响未见报道。本研究通过慈竹转录组数据库、在线NCBI基因组数据库及毛竹基因组数据库,同源克隆得到两个CesA基因,BeCesA1(GenBank注册号:KY435488)和BeCesA7 (GenBank注册号:KY435489),分别编码1 078和1 053个氨基酸残基。保守结构域分析及多重序列比对分析表明,慈竹BeCesA1和BeCesA7蛋白均在N端存在一个RING finger结构和两个高度可变区域。组织表达结果表明,BeCesA1和BeCesA7两个基因在竹不同组织中表达模式各不相同,但均在100 cm笋等组织中高表达,然而BeCesA7的表达量明显高于BeCesA1。在竹的发育过程中,BeCesA1基因随着笋的发育表达量逐渐降低,而BeCesA7则随着笋的发育逐渐增高。外源施加GA3后,以BeCesA1的CK未展开叶为参照,BeCesA1在茎秆中的表达量降低,而BeCesA7则在茎秆中的表达量增加。     

陆地棉GhBZR1基因的克隆及功能研究

[目的]BZR1是油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)信号通路中关键的转录因子,去磷酸化后可直接调控BR信号通路下游基因的表达,影响植物的生长发育和免疫反应.明确其功能对了解棉花的抗/感病分子机制具有重要意义.[方法]分析未接种和接种黄萎病菌(大丽轮枝菌,Verticilium dahliae)的中植棉K...     

丹参SmTIR1基因的克隆及生物信息学分析

生长素受体在植物生长素调控植物生长发育过程中起关键作用,而丹参的生长发育直接影响其品质,但目前有关丹参生长素受体基因的研究仍未见报道.本研究通过克隆获得一条全长1887 bp cDNA序列,并对所获得的克隆序列进行生物信息学分析.丹参生长素受体基因TIR1(命名为SmTIR1)具有典型的TIR1基因结构,通过预测其潜在...     

猪博卡病毒NP1基因的克隆与原核表达

猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒.本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,...     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

大豆苹果酸脱氢酶基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术获得大豆中的苹果酸脱氢酶基因cDNA序列,并对基因及其编码蛋白进行生物信息学分析和预测,为进一步克隆该基因、解决植物磷高效基因数量缺乏等问题提供依据。结果表明,大豆中的苹果酸脱氢酶基因(GmMDH1)cDNA序列长度为1 574 bp,开放阅读框1 230 bp,编码409个氨基酸残基;编码蛋白含有NAD bindingsite,Dimerization interface,Substrate binding site,MDH_glyoxysomal_mitochondrial结合位点和保守域,属于LDH_MDH_like Superfamily家族;亚细胞定位分析显示,编码蛋白位于植物细胞的叶绿体中。     

马铃薯块茎RNA提取及RT-PCR法克隆酸性转化酶基因

马铃薯块茎由于富含多糖和酚类物质造成RNA提取难度大。通过在SDS-phenol提取缓冲液中加入2％PVP及10mmol／L半胱氨酸以除去大量的酚类物质，利用改进后的SDS-酚法提取的马铃薯块茎总RNA电泳结果表明，总RNA质量高于未经改进的方法。并进行RT—PCR克隆与马铃薯块茎低温糖化反应过程密切相关的块茎酸性转化酶(acid invertase)基因，经核酸序列对比分析，与公布的己知序列具有98．96％的同源性，为利用反义技术抑制酸性转化酶活性进行马铃薯块茎抗低温糖化研究作好了准备工作。     

大豆吡哆醇生物合成蛋白基因(PDX)的电子克隆和进化分析

电子克隆(In silicocloning)是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。根据物种间同源基因相对保守的特点,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)吡哆醇生物合成蛋白cDNA序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了1 280 bp长的大豆吡哆醇生物合成蛋白的基因序列(GenBank登陆号为DQ139265)。经过RT-PCR扩增、基因组PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,20~955 bp),编码311个氨基酸。通过与水稻、日本百脉根、烟草、截形苜蓿等物种的吡哆醇生物合成蛋白序列比对,发现该基因具有高度的保守性。表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索、筛选、拼接,是克隆基因的有效途径。     

对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定

采用12个3''锚锭引物和8个5''随机引物构建引物组合, 运用DDRT-PCR差异显示方法, 分析NCo376和F134两品种接种黑穗病菌前后的基因表达差异。经克隆、测序和半定量RT-PCR验证, 获得7条真实差异表达片段, 这些片段分别同GenBank中编码细胞色素C氧化酶基因、核糖体蛋白基因、NAD-依赖型苹果酸脱氢酶基因、氨基转移酶基因、乙烯响应相关结合蛋白基因、RNA聚合酶特异转录起始因子和反转录转座子的序列的同源性达28%~99%。半定量RT-PCR分析表明, 细胞色素C氧化酶基因的表达受甘蔗黑穗病菌和水杨酸的调控, 不依赖于过氧化氢的作用机制, 在甘蔗根、茎、叶中表达的抗病基因组成型表达, 但表达水平较低。推测甘蔗受黑穗病菌侵染后, 可能通过细胞色素C氧化酶基因的诱导, 促使植保素合成增多, 以此抵抗或抑制病原菌的胁迫。该结果丰富了甘蔗与黑穗病菌互作的分子机制研究, 为甘蔗抗黑穗病分子育种奠定了基础。     

甘蔗葡聚糖酶ScBG1基因的电子克隆及序列分析

为了揭示甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的结构特点和功能特性,从而为该基因的研究和应用提供基础。本研究以水稻β-1,3-葡聚糖酶基因(U72255.1)为搜寻探针,运用电子克隆技术,获得一条甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为ScBG1,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因的cDNA序列全长为1842 bp,包含一个1488 bp完整的开放读码框,编码495个氨基酸残基,属于糖基水解酶第十七家族,为疏水性蛋白,含有信号肽。将ScBG1与其他植物种的β-1,3-葡聚糖酶基因进行序列比对,发现该基因具有保守和典型的葡聚糖酶结构域,碱基序列的保守性为45%~73%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础,也为甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的分子功能研究提供参考。     

蒙古羊BMP15全长DNA序列的克隆与分析

BMP15基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用.根据其他物种BMP15基因的保守序列设计特异性引物,扩增蒙古羊的全长DNA序列.从蒙古羊的血液中提取总DNA,采用PCR技术扩增出蒙古羊BMP15 DNA序列.将此片段克隆到PMD18-T载体中,经菌落PCR鉴定和DNA序列测定分析验证,证实所克隆序列BMP15为骨形态发生蛋白,符合骨形态发生蛋白基因的特征.序列分析表明,该DNA包含两个外显子序列和一个内含子序列以及两端的非翻译序列,全长6 642 bp,编码393个氨基酸,蒙古羊与牛的同源性最高(98.6%),与猪的同源性为90.5%.     

大豆吡哆醛激酶基因的克隆与表达分析

以拟南芥吡哆醛激酶基因(PK)的蛋白质序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为1102 bp的大豆吡哆醛激酶基因的cDNA序列,经RT-PCR克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列一致(GenBank登录号为DQ006813).该eDNA序列的开放阅读框(0RF)位于第119～1045位,推测编码308个氨基酸.采用半定量RT-PCR方法研究了该基因的组织特异性表达情况和对强光逆境的反应,结果表明该基因在大豆根茎叶中都有表达,对强光逆境不敏感.将大豆PK基因编码的蛋白序列与马铃薯(Solanum tuberosum,AAY85186)、拟南芥(Arabidopsis thaliana,AAK94021)、水稻(Oryza sativa,ABA99785)、小麦(Triticum aestivum,AAR00318)和油菜(Brassica napus,ABE73472)的吡哆醛激酶蛋白序列进行比对,发现其一致性分别为:81%,75%,78%,79%和76%.比对结果说明在植物中该基因编码的蛋白质存在显著的相似性.根据蛋白比对结果绘制的系统发育树基本代表了它们在经典分类上的地位.     

向日葵甜菜碱醛脱氢酶的电子克隆与分析

采用电子克隆技术获得了向日葵甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA序列(HaBADH)。该序列长1901bp,编码一个由503个氨基酸残基组成的蛋白质。HaBADH与其他物种的BADHs在蛋白质水平上表现较高的相似性,在进化上与同科的甘菊BADH蛋白距离较近。HaBADH蛋白具有醛脱氢酶家族高度保守的十肽和与酶功能有关的氨基酸残基Cys。     

奶牛乳房炎抗性相关基因Znf313的电子克隆与序列分析

电子克隆是基因克隆的新策略。利用一个患乳房炎奶牛外周血白细胞中差异表达的EST序列为信息探针进行电子克隆,根据电子克隆序列设计引物,以奶牛外周血白细胞cDNA为模板进行RT-PCR验证,PCR产物克隆入pGEM-T质粒载体,测序得到的序列已被GenBank收录（DQ010409）。该基因被命名为牛锌指蛋白313(Znf313)基因,开放阅读框1~693bp,推测编码230个氨基酸,预测其编码蛋白分子量为25.67kD,等电点6.90。     

大豆尿黑酸叶绿基转移酶基因的克隆与进化分析

采用基于EST的电子克隆方法,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的尿黑酸叶绿基转移酶基因(Homogentisate phytyltransferase,HPT)cDNA序列为信息探针,对大豆的EST数据库进行同源检索筛选,获得了1 777 bp长大豆HPT基因的cDNA序列(GenBank登录号为:AY956421),经RT-PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,表明与电子克隆序列一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,173～1 408 bp),推测编码411个氨基酸的蛋白。该蛋白与拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、光合集胞蓝细菌(Synechocystis)的序列进行了比较,发现该基因具有保守性。