茶氨酸生物合成工程菌构建

通过PCR扩增E.coli DH5α的γ-ggt基因,产物经纯化后用Kpn I和Xho I双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到E.coli BL21中,获得工程菌。工程菌株经0.05βmol/L IPTG,32℃诱导表达,湿菌体的酶活达到2.0βU/g,大约是出发菌株E.coli DH5α的15倍。工程菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29.40βg/L,L-Gln的转化率为48.22%,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coli DH5α提高了100多倍。     

茶树叶片GDH、GS、GOGAT基因的克隆及荧光定量PCR分析

以4个茶树种质为试验材料,克隆得到茶叶中氨基酸合成转化关键酶基因：谷氨酸脱氢酶（GDH）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺α-酮戊二酸氨基转移酶（GOGAT）的保守区。在GenBank登录号分别为：JN602371、JN602372、JN602373。通过SYBR Green I实时荧光定量PCR检测,发现GDH酶基因在茶树种质0314C（相对高氨基酸种质）中的表达显著增强,而在0212-15种质（相对低氨基酸种质）中却显著下降。GS、GOGAT酶基因在种质0314C中表达显著下降,而在0212-15、0318D种质中显著增强。通过回归分析,GS基因表达与茶氨酸、赖氨酸、丙氨酸呈负相关,而GDH与茶氨酸呈正相关。     

类茶氨酸合成酶基因家族在番茄中的鉴定及表达研究

茶树体内的茶氨酸合成酶(Theanine synthetase synthetase,TS)和部分谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)家族成员都具有催化乙胺和谷氨酸合成茶氨酸的活性.我们将植物中这类与茶树TS序列高度相似,且具有茶氨酸合成活性的酶,统称为类茶氨酸合成酶(Analogue th...     

酶性氧化合成茶黄素条件优化的研究

利用提取粗酶液在单因素试验和正交试验进行合成茶黄素以及在此基础上利用捣碎茶鲜叶（不提取粗酶液）直接进行合成茶黄素试验以确定最优反应条件。结果表明,在本试验反应体系中,茶黄素酶促合成的最佳条件（茶黄素总量）为：温度为30℃,反应体系的最佳pH值为4.8,底物浓度为0.9βg/100βml,酶源物浓度为28βg/100βml（以鲜叶重量计）,通氧量为0.4βL/min,最佳反应终止时间是40βmin。其中温度和pH值是反应体系中两个极其重要的影响因素（P<0.05）;通氧量也是影响茶黄素酶性合成的必不可少的条件之一。     

茶树悬浮细胞茶氨酸生物合成动态研究

对不同外植体来源的茶树培养细胞的茶氨酸生物合成能力、适宜培养细胞合成茶氨酸的培养基条件、培养细胞茶氨酸生物合成动态和更新培养基对提高培养细胞茶氨酸累积含量的效果等进行了分析。在一个培养周期中,培养细胞的茶氨酸累积高峰出现在第11βd左右。在以每10βd更新一次培养基的条件下,培养细胞茶氨酸合成能力可维持至第30βd左右,达到细胞干重的近20%。     

茶鲜叶中 L-茶氨酸的代谢

L—茶氨酸(谷氨酰氨基乙胺)——绿茶滋味中的一种主要成分,是由谷氨酸和乙胺在茶氨酸合成酶的催化下,在茶根中合成的。它在鲜叶中的含量为0.5—2%。业已证实在茶籽中茶氨酸有相当数量的乙胺曾转移到幼苗中的儿茶素分子上,这就支持了茶氨酸不是一终产物而是参与茶树其它化合物的生     

大规模悬浮培养茶叶细胞合成茶氨酸培养基组成优化研究

婺源绿茶嫩叶用MS培养基（加IBA 2βmg/L,6-BA 4βmg/L,盐酸乙胺25βmmol/L）进行茶叶愈伤组织悬浮培养,采用正交试验设计研究了培养基不同组成条件对茶叶细胞大规模悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合成的影响。结果显示,整个培养周期中,细胞收获量和茶氨酸积累量峰值出现时间为培养的第19~22βd;在NH₄⁺/NO₃^- 1.0/60.0βmmol/L、K⁺ 100.0βmmol/L、Mg²⁺ 3.0βmmol/L、H₂PO₄^- 3.0βmmol/L、蔗糖30.0βg/L、水解酪蛋白2.0βg/L条件下,茶叶细胞生长量和茶氨酸积累量分别可达到16.33βg/100βml培养液和3.357βg/100βml培养液;提高培养基中水解酪蛋白浓度可使细胞对数生长期和稳定期得到延长,并有利于茶氨酸积累;H₂PO₄^-浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性,低H₂PO₄^-浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值,高H₂PO₄^-浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间;K⁺ 和蔗糖对细胞生长的影响均不明显;Mg²⁺对细胞生长产生明显的影响;NH₄⁺/NO₃^-对茶氨酸合成具有非常显著的影响。从生产效率考虑,培养周期以19~22βd为宜。     

茶树发根中茶氨酸和儿茶素类含量的分析

茶树发根在LG₀培养基和添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基上生长迅速,但只在一个培养于LG₀培养基的发根克隆中检测到高含量的茶氨酸,含量达到23.12βmg/g鲜重,高于未转化根的18.77βmg/g鲜重。除茶氨酸外,该发根克隆中也检测到高含量的天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸。发根克隆培养于添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基,茶氨酸的含量则显著降低,说明培养基组成也是影响发根中茶氨酸的含量的因素之一。茶树发根中也含有少量的儿茶素类单体,主要为儿茶素和表儿茶素。     

茶氨酸的衍生化及毛细管电泳定量技术

采用胶束电动力学毛细管电泳技术定量茶氨酸,以2,4-二硝基氟苯为衍生化试剂,建立茶氨酸定量的新方法。运行缓冲液为pH9.8的0.03βmol/L四硼酸钠缓冲液体系,分离电压为28kV,分离温度为17℃,在360βnm下进行检测。研究了不同pH、反应时间、反应温度、缓冲液浓度对衍生化反应的影响,确立了衍生化反应的最佳条件。证实了4℃和25℃环境下衍生化产物可以稳定保存5天。测定了茶氨酸衍生化方法的性能指标：线性范围为0.2~5βmmol/L（r²=0.993）,最低检测限为0.05βmmol/L。     

酶法拆分DL-茶氨酸及其分离纯化

将DL-茶氨酸乙酰化为N-乙酰-DL-茶氨酸,利用本实验室筛选的有较高氨基酰化酶活性的真菌刺孢小克银汉霉9980（Cunnighamella echinulata 9980）对DL-茶氨酸进行拆分并对拆分条件进行摸索。结果表明：反应最适温度50℃,最适pH7.0,底物浓度0.5mol/L,湿菌体量4g/100βml,拆分时间30h,拆分率可达92％。产物经JK008阳离子交换树脂氨性柱分离,L-茶氨酸收率84.3％,[α] =8.1(c=2,H₂O), 符合JP2000药典。     

利用GS基因构建茶氨酸生物合成工程菌的研究

为了高效合成茶氨酸,本研究通过将荧光假单胞菌GS基因转接入pET32a质粒中,再将重组质粒转化到E.coli BL21中,构建了一种生物合成茶氨酸的基因工程菌。工程菌株经0.1mmol/LIPTG,28℃诱导表达,湿菌体的酶活达到41.79U/mg prot,大约是出发菌株E.coli BL21的126.64倍。工程菌催化L-谷氨酸钠和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到6.2g/L,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力较出发菌株E.coliBL21有显著提高。     

高纯度茶氨酸的合成与特性(英文)

报道了一种改进的茶氨酸(γ-谷酰基乙胺)的合成方法,包括L-谷氨酸的去氢成为吡咯烷酮羟酸(PCA),然后再加纯的乙胺(99%,气-液)反应,得率92.6%,再在84%乙醇溶液中重结晶后,高纯度茶氨酸(A型) 的得率37.4%。其结晶在透视和扫描电镜下呈长方形棱柱,具丝光状。A型茶氨酸的融点为224℃。B型茶氨酸从L-PCA合成,为甘蓝叶状,边缘呈波浪型,融点217—218℃。用HPLC分析证明,A和B型茶氨酸是混合异构体,A型含47.9%的L-茶氨酸,B型含90.9%的L-茶氨酸,100%的L-茶氨酸的旋光度(á)为+8.57。     

基因工程菌生物合成茶氨酸条件研究

研究了不同诱导条件对基因工程菌催化合成茶氨酸的影响,确定了较为优化的诱导表达条件;通过单因子试验研究了不同反应条件对基因工程菌催化合成茶氨酸的影响,研究结果表明反应体系中较高的菌体浓度对催化茶氨酸有一定的抑制作用;高L-Gln浓度可以提高茶氨酸的生成量,但是却降低了L-Gln的转化率;基因工程菌催化合成茶氨酸的最适pH是9.5左右,较为适合的反应温度是32℃~37℃。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

茶氨酸合成酶基因的SNP挖掘和遗传定位

茶氨酸合成酶(Theanine synthetase,TS)基因是茶树茶氨酸代谢过程中的关键酶基因。本研究以氨基酸含量差异明显的亲本及其杂交所得F_1子代为研究材料,克隆TS基因的c DNA序列,挖掘其SNPs位点,并成功将杂合SNP位点定位在遗传连锁群上。研究结果显示,通过序列比对在亲本间检测到3个SNPs,验证得到1个杂合的位点SNP735。将此位点成功转化为dCAPS标记,该标记在子代中的基因型分离比为1∶1,利用该群体已构建的茶树遗传图谱进行遗传定位,将dCAPS标记定位在连锁群LG03上,相邻标记为TM299和TM517。联合此标记及其相邻标记与游离氨基酸总含量和茶氨酸含量进行统计分析,表明具有显著的相关性。     

大豆异黄酮和皂甙对肝癌前病变大鼠血清标志酶及抗氧化活性的影响

采用改良Solt-Faber法建立大鼠肝癌前病变模型,以大豆异黄酮和皂甙饲喂大鼠42 d后,ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α),分光光度法测定γ-谷酰胺转肽酶(γ-GT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量。结果表明:大豆异黄酮和皂甙降低肝癌前病变大鼠血清γ-GT、ALT、AST活性,升高血清SOD、CAT、GSH-PX活性和降低MDA以及NO水平,但对血清TNF-α水平没有显著影响。表明大豆异黄酮和皂甙具有明显的抗化学致癌作用,其作用机制可能与增高抗氧化活性有关。     

水稻灌浆成熟期籽粒谷氨酰胺合成酶活性变化及其与稻米品质关系的初步研究

 选用稻米蒸煮食味品质有显著差异的4个粳稻品种，通过盆栽试验对水稻灌浆成熟期籽粒谷氨酰胺合成酶活性变化及其与稻米蒸煮食味品质关系进行了初步研究。结果表明，水稻灌浆过程中籽粒谷氨酰胺合成酶活性随灌浆进程逐渐增加，达到峰值后又逐渐下降，呈单峰曲线变化；抽穗15 d以前蛋白质含量高的品种谷氨酰胺合成酶活性大于蛋白质含量低的品种，而以后与之相反；灌浆前期，籽粒谷氨酰胺合成酶活性与味度值、最高黏度、崩解值间呈负相关，灌浆中、后期呈正相关，而与籽粒最终蛋白质含量和黏滞峰消减值在灌浆前期呈正相关，灌浆中、后期呈负相关，而且相关程度随灌浆时段而发生变化；抽穗后15~20 d是籽粒谷氨酰胺合成酶活性与味度值、RVA谱特性间的相关性质发生变化的转折时期。