细胞周期素家族基因在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中的转录特征

细胞周期蛋白(cyclin)是真核生物细胞有丝分裂的重要调节蛋白,家蚕具有5种类型细胞周期蛋白基因。以4龄将眠蚕、4龄眠蚕和5龄起蚕为材料,采用定量PCR方法分析5种细胞周期蛋白基因在4龄幼虫蜕皮过程的组织表达特征为:5种类型cyclin基因在生殖腺中都高表达,其中cyclinE在眠中表达量最高,其它4种类型cyclin基因在将眠时表达量最高,证实4龄眠期是家蚕生殖腺细胞发生有丝分裂的重要时期;5种类型cyclin基因在马氏管中都有表达,其中cyclinA和cyclinB3在4龄将眠蚕的马氏管中存在表达高峰,推测和马氏管内表皮更新相关;除cyclinL1在眠蚕丝腺的表达量很低外,cyclinA、cyclinB、cyclinB3和cyclinE在眠蚕丝腺中都存在表达高峰,可能和丝腺的内表皮更新相关;cyclinA、cyclinB、cyclinB3在脂肪体中的表达量较高,且在将眠时或眠中存在表达高峰,推测和脂肪体中能量物质的积累相关;5种类型cyclin基因在脑、血液和中肠的表达量都很低,且蜕皮前后的变化规律不明显。研究结果提示:在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中,cyclin基因的转录特征不仅和来源于外胚层组织的表皮更新相关,还和生殖腺的发育及脂肪体中能量物质的积累存在相关性。     

家蚕细胞周期素家族基因的克隆及结构特征与表达分析

细胞周期素(cyclin)是推进细胞周期进程最主要的调控因子之一,并与个体发育及肿瘤形成等有关。为研究细胞周期素家族基因在家蚕组织中的表达情况,利用家蚕基因组数据库信息设计引物克隆了家蚕细胞周期素家族的5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,cyclinA、cyclinB、cyclinB3基因分别有7个外显子,cyclinE基因有8个外显子,cyclinL1基因只有1个外显子;cyclinA及cyclinE基因存在较多的剪切方式,cyclinA主要包含大小为2 141和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7外显子,cyclinE则含有1 422、1 290及1 194 bp等大小不同的序列,变化集中于第5～7外显子,而cyclinB、cyclinB3及cyclinL1基因则相对稳定。克隆的家蚕细胞周期素家族基因的组织表达存在差异:cyclinA基因只在精巢中表达,cyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,cyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,cyclinB和cy-clinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究不同细胞周期素在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。     

家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究I．家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析

以大规模EST测序为基础，用生物信息学方法分析了家蚕5龄3d脂肪体组织基因表达的特征，共获取脂肪体组织EST 12 721个。经Plarap程序拼接得到2316个非冗余序列，其中包括824个contigs，l492个singletons。在鉴定出的已知基因中，基因表达频率有明显差异：物质代谢相关基因表达量最高，占总量的58．2％；其次为转录翻译调节相关基因和酶类基因，分别占15．5％和14．5％。在高量表达基因中，有贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂、类IDGF蛋白、抗菌蛋白、谷胱甘肽-S转移酶等。结果表明，脂肪体组织基因表达的种类很多，特征明显，与脂肪体在蚕体内的贮藏功能、蛋白质合成功能、代谢调节功能以及变态发育有密切关系。     

家蚕氨肽酶N家族基因在5龄幼虫中肠组织的表达分析

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一种偏好水解蛋白质或寡肽N端中性氨基酸的酶,在鳞翅目昆虫中主要分布于中肠上皮细胞的刷状缘囊膜上,是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体(Cry)毒素的重要受体蛋白。为了研究家蚕APN家族基因的表达特征,运用Real-time PCR技术检测分析该家族基因在不同家蚕品种幼虫中肠组织的表达差异以及同一家蚕品种幼虫中肠组织中该家族基因各个成员的表达丰度。在所有供试家蚕品种的幼虫中肠组织均可检测到APN家族基因的表达,但不同化性家蚕品种间APN基因的表达水平存在显著差异(P<0.05),而相同化性品种间的差异较小(P>0.05);在同一家蚕品种幼虫中肠组织中,APN2、APN4、APN5基因的表达量较高,而APN1及APN3基因的表达量较低。研究结果有助于进一步研究家蚕APN家族基因的作用机制,并为家蚕抗Bt品种的选育提供理论依据。     

家蚕防御素基因的序列特征与表达模式分析及原核表达试验

家蚕防御素(defensin)是家蚕抗菌肽家族的主要成员之一,为家蚕先天性免疫的重要效应因子。采用生物信息学方法分析家蚕防御素基因BmdefA、BmdefB的序列中各有2个外显子,2个基因分别定位于家蚕第4号和第13号染色体上;等电点预测BmdefA带有负电荷,属于罕见的阴离子型抗菌肽,而BmdefB带有正电荷,属于常见的阳离子型抗菌肽;预测2个基因编码的成熟肽分子质量均在4 kD左右。用RT-PCR方法检测BmdefA在家蚕整个发育过程中有表达,且在检测的幼虫和成虫各组织中均有表达;BmdefB从幼虫5龄第3天到成虫期表达,雄性表达量高于雌性,且在5龄第3天幼虫的生殖腺、脂肪体和血细胞中高水平表达。家蚕防御素BmdefA、BmdefB具有不同的分子特性和表达特征,暗示它们在家蚕先天免疫过程中可能行使不同的功能,甚至可能具有不同的抗菌机理。构建融合GST标签的家蚕防御素基因原核表达载体,通过在大肠杆菌细胞内诱导表达,获得可溶性的目的蛋白,使用GST亲和层析柱初步纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting鉴定,为进一步研究BmdefA、BmdefB的体外活性和抑菌机制奠定基础。     

家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究Ⅰ.家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析

以大规模EST测序为基础 ,用生物信息学方法分析了家蚕 5龄 3d脂肪体组织基因表达的特征 ,共获取脂肪体组织EST 12 72 1个。经Phrap程序拼接得到 2 316个非冗余序列 ,其中包括 82 4个contigs,14 92个singletons。在鉴定出的已知基因中 ,基因表达频率有明显差异 :物质代谢相关基因表达量最高 ,占总量的 5 8 2 % ;其次为转录翻译调节相关基因和酶类基因 ,分别占 15 5 %和 14 5 %。在高量表达基因中 ,有贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂、类IDGF蛋白、抗菌蛋白、谷胱甘肽 S转移酶等。结果表明 ,脂肪体组织基因表达的种类很多 ,特征明显 ,与脂肪体在蚕体内的贮藏功能、蛋白质合成功能、代谢调节功能以及变态发育有密切关系。     

家蚕细胞周期蛋白E(Cyc E)基因的2种剪切体克隆及其蛋白质的亚细胞定位

细胞周期蛋白E(Cyc E)是细胞从G1期转换到S期的重要调节因子。为了解家蚕Cyc E的功能,从家蚕BmN细胞中克隆了2种不同剪切方式的cyc E片段,分别命名为cyc E1173和cyc E837(GenBank登录号:HQ619696.1,HQ619697.1),将2种剪切体分别融合eGFP后利用杆状病毒系统在BmN和Sf9细胞中进行表达产物的亚细胞定位实验。家蚕cyc E的2种剪切方式的变化主要集中在第5～6外显子处。Cyc E1173和Cyc E837在2种细胞系中都定位于细胞核,但在Sf9细胞中存在Cyc E1173的荧光逐渐聚集到核膜及核心荧光弱化的现象,而在BmN细胞中,Cyc E1173和Cyc E837的荧光分布均匀,这种差异的原因可能与Cyc E出核降解相关。Western blotting检测在Sf9细胞中表达的Cyc E1173出现2条降解条带,而Cyc E837的融合蛋白并无这种降解情况,其可能的原因是cyc E1173和cyc E837之间存在表达产物降解水平上的差异,Cyc E1173更容易降解,推测其与细胞周期调控的关系更为密切。     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

化学感受蛋白家族基因在家蚕5龄幼虫表皮中的表达分析

化学感受蛋白(chemosensory protein,CSPs)在昆虫的免疫反应、生长发育及信号传递过程中起重要作用。以耐高温家蚕品种为材料,研究高温饲养环境下,作为家蚕物理屏障及感觉器官的表皮中化学感受蛋白基因的表达变化。依据从家蚕基因组数据库获得的15个家蚕CSPs基因(Bm CSPs)的序列设计引物,通过RT-PCR检测正常饲育温度(28℃±0.5℃)下,Bm CSP1、Bm CSP4、Bm CSP6、Bm CSP7、Bm CSP8、Bm CSP9、Bm CSP11和Bm CSP15等8个基因在家蚕5龄第2天幼虫的表皮中有表达;通过半定量RT-PCR和qRT-PCR检测在高温(35℃±0.5℃)饲育环境下,5龄第2天幼虫表皮中Bm CSP8和Bm CSP15的表达水平显著上调,其他6个Bm CSPs基因的表达水平未见显著变化。初步推测Bm CSP8和Bm CSP15可能与家蚕幼虫对高温环境的应激反应有关。     

家蚕凋亡蛋白酶(caspase-1)基因在大肠杆菌中的表达

为了研究家蚕凋亡蛋白酶(caspase-1)的原核表达及剪切方式,用PCR法扩增出家蚕caspase-1基因的cD-NA,然后插入pET28a载体,得到阳性质粒pET28a-caspase-1,并转化感受态细胞BL21,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导了caspase-1蛋白的表达。应用SDS-PAGE和Western blot分析对其性质作检测,诱导3 h后caspase-1蛋白得到剪切,5 h开始降解。研究结果表明,caspase-1基因可在大肠杆菌BL21中诱导表达,并且能够进行自我剪切。     

家蚕5龄幼虫蛋白水解酶的最适反应温度和pH值

调查了家蚕(华峰×雪松)5龄幼虫的血液、消化液以及脂肪体蛋白水解酶的反应条件,发现其最适反应温度均在37℃左右,最适反应pH分别为80、98和68左右。血液蛋白水解酶在pH68~98之间其活力变化不大。     

家蚕vasa样基因表达的可变剪接

VASA样蛋白是决定生殖系发育的重要调控蛋白因子之一,具有广泛的保守性,因此vasa的表达被认为是生殖细胞中最可靠的分子标记。为研究家蚕vasa样基因(Bombyx mori vasa-like gene,Bmvlg)的基本结构特征,通过RT-PCR从家蚕雄性性腺组织中获得了4个不同长度的BmvlgcDNA片段。经克隆分析,其中一个完整的BmvlgcD-NA全长1 806 bp,编码全长601个氨基酸的家蚕VASA样蛋白,该蛋白的结构特征与已知同源VASA样蛋白的结构特征基本一致;另3个不同长度的BmvlgcDNA均有各自的起始密码子和终止密码子。推测Bmvlg基因可能存在着多种可变剪接。     

家蚕经菊酯类农药诱导后脂肪体蛋白的表达谱及烯醇酶基因的组织转录活性

为了从蛋白质水平探讨家蚕对菊酯类农药的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,分析家蚕5龄幼虫经氯氰菊酯诱导前后脂肪体蛋白的表达特征。采用ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到432个蛋白点,诱导实验组检测到369个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有342对,匹配率为76.68%。对特征蛋白进行MALDI-TOF-MS分析鉴定的蛋白包括烯醇酶、线粒体醛脱氢酶、伴侣素、肌动蛋白、gag-like蛋白。烯醇酶(enolase)是糖酵解过程中极为重要的酶类。采用半定量RT-PCR对经氯氰菊酯诱导后的家蚕脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、血液等7个组织器官的烯醇酶基因进行表达分析,结果表明,烯醇酶基因转录水平在7个组织器官中都呈现下调趋势,分别下调了13.79%、10.71%、22.48%、7.40%、27.00%、11.50%、14.52%,其中脂肪体的烯醇酶基因表达和蛋白的表达下调一致。受菊酯类农药诱导的影响,家蚕5龄幼虫脂肪体蛋白的数目减少,烯醇酶基因在各组织器官减量表达,提示可能与蚕体的基础生理代谢受到抑制有关。     

家蚕5龄幼虫蛋白质代谢研究初探

家蚕幼虫5龄期间蛋白质含量的变化约为体重变化的3倍,整个蚕体的蛋白质含量在第3和第4天之间有一个明显的突增。分析相应的蛋白水解酶活力变化,发现酶活力呈现先升后降的变化趋势,在第4和第5天时活力达到峰值。进一步提取血液、消化液以及脂肪体蛋白水解酶进行研究,结果表明血液和消化液蛋白水解酶的活力变化与蚕体消化、吸收和转化桑叶蛋白的生理进程基本一致。     

家蚕几丁质脱乙酰基酶基因结构及mRNA选择性剪接与表达差异的研究

几丁质脱乙酰基酶(CDAs)是调控昆虫生长发育过程中的蜕皮生理、组织生长和抗病免疫等的重要酶类。利用cDNA末端快速扩增(RACE)法克隆了家蚕CDAs基因的cDNA全长序列,鉴定出BmCDA基因mRNA存在2种剪接体,命名为BmCDA1和BmCDA2,外显子遗漏是这2种剪接体mRNA的主要剪接模式。生物信息学分析表明,BmCDA基因由6个外显子和5个内含子组成;推测BmCDA1和BmCDA2编码氨基酸序列都包含几丁质脱乙酰基结构域、几丁质结合(ChBD)结构域和低密度脂蛋白受体A类(LDLa)结构域等3个功能域,但二者的ChBD结构域有部分氨基酸残基不同。基于功能域基序和系统进化分析,昆虫CDA蛋白可分成5大类,BmCDA1和BmCDA2属于第1大类,是具有全部3个功能域的典型昆虫CDA蛋白。荧光定量PCR分析表明BmCDA表达不仅具有发育时期特异性,而且具有组织特异性:在幼虫和蛹蜕皮前后的表达量最高,蜕皮后第2天表达量最低;在幼虫蜕皮时发生激剧变化的表皮、气管和中肠等组织中的表达量显著高于变化较小的中部丝腺和脂肪体等组织;BmCDA1主要在表达量高的发育时期和组织中表达,BmCDA2主要在表达量低的组织中表达。研究结果有助于进一步解析昆虫CDAs基因的功能和调控机制。     

家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。     

家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。     

家蚕核型多角体病毒egt基因在大肠杆菌中的表达

利用ＰＣＲ技术对已克隆的ＢｍＮＰＶＺＪ ８株的ｅｇｔ基因５′端非编码区序列进行删除,并将ＰＣＲ片段克隆到质粒ｐＢａｃＰＡＫ８中,测序结果表明ＰＣＲ扩增的片段完全正确,接着将经过改造的ｅｇｔ基因克隆于大肠杆菌表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,在大肠杆菌中高效表达了ＢｍＮＰＶｅｇｔ基因。同时,对Ｂｍ ＮＰＶｅｇｔ基因的密码子使用作了分析。     

家蚕类胰凝乳蛋白酶基因的发掘与表达特征分析

类胰凝乳蛋白酶(CTLP)是鳞翅目昆虫幼虫中肠中的主要蛋白酶。基于构建的家蚕中肠等组织差异表达基因的SSH文库,发掘和克隆了一条新的家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp(GenBank登录号:JQ081296)。该基因定位于18号染色体nscaf2901,靠近端粒,有5个外显子和4个内含子,全长cDNA序列976 bp,ORF为840 bp,编码279个氨基酸残基,信号肽序列1～18 aa(分值0.985),1～20 aa和50～100 aa区域为2个由内到外的跨膜螺旋,推测蛋白质相对分子质量为29 780.10,pI为8.75,蛋白质功能域(保守区)和分子进化分析显示其为丝氨酸蛋白酶家族的类胰凝乳蛋白酶。家蚕Ctlp基因具有在5龄幼虫中肠特异性高表达和伴随进食量增加而上调表达的特征,同时也具有性别差异性和熟蚕期特异性上调表达的现象,暗示CTLP可能具有促进消化以外的功能。构建pET32a-ctlp重组表达载体,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示,重组蛋白在原核表达系统中的表达量较低。