新城疫病毒广西强毒株的分离与鉴定

从广西某规模化鸡场两个鸡群病死雏鸡中分离到2株有血凝性的病毒，这2株病毒的血凝性均能被新城疫标准阳性血清抑制和中和，经过血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、血清中和试验和RT-PCR检测结果，确定为新城疫病毒。2株病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为52和54h，脑内致病指数(ICPI)分别为1．975、1．875；鸡胚半数致死量(ELD50)分别为：10^-9.38／0.1mL、10^-9.68／0．1mL，实验结果证明该2株病毒为新城疫病毒强毒株。     

鸡新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

从河北、天津、北京等省市发病鸡群中分离到8株有血凝性的分离物,其血凝作用可被新城疫阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS76阳性血清所抑制,表明8株分离物均为新城疫病毒。利用鸡胚终点稀释法对这8株NDV进行了克隆。对8株NDV的毒力指数(MDT、ICPI、IVPI)测定结果显示:MDT在42 9～49 5h之间,ICPI在1 95～2 00之间,IVPI在2 68～2 89之间。表明8株NDV均为新城疫病毒强毒株,其毒力与标准强毒株F48E8相近。各分离毒株经2%磷钨酸负染后,电镜下观察,可见丝状、圆形或不规则形态的病毒粒子,表面有纤突样结构。各毒株的大小不尽相同,粒子直径或长轴在100～500nm之间。     

鸡新城疫病毒地方野毒株的分离鉴定与致病性试验

从某一疑似新城疫病例的蛋鸡群中分离到一株病毒，经HA和HI试验、血清中和试验和动物回归试验。最终确认所分离毒株为新城疫病毒。经对分离株的MDT、ICPI和IVPI等致病指数的测定，表明该毒株为新城疫强毒株。     

广西山雉新城疫病毒分离株生物学特性测定

对1株从广西某山雉养殖场发病山雉中分离得到的新城疫病毒进行生物学特性测定.结果显示,分离株的鸡胚平均死亡时间(MDT)为50.4h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.58,F蛋白核苷酸序列与新城疫标准强毒株F48E9株的核苷酸同源性为84.5%,与Lasota的核苷酸同源性为81.8%,推导氨基酸在裂解位点的序列是112G-R-R-Q-K-R-F117.通过MDT、ICPI和推导氨基酸裂解位点分析,确定分离株是一株毒力较强的新城疫病毒强毒株.     

15株NDV地方株的分离鉴定与生物学特性

从1998~2002年河南省洛阳地区代表性新城疫发病禽群中分离鉴定了15株新城疫病毒(NDV),并对其生物学特性进行了研究。结果表明,15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制特性;对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制;对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT),1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉内接种的致病指数(IVPI)的测定证实,LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株,其余均为强毒株;弱毒株的血凝素热稳定性较好,属慢速血凝解脱型;强毒株的血凝素热稳定性差,属快速或中速血凝解脱型;所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较大。对HI抗体为6log2的12日龄雏鸡攻毒试验结果表明,15个分离株中2个弱毒株可得到100%保护;13个强毒株中,LG-1-99,LR-1-98,LD-4-01和LD-3-00得到了70%~90%的保护,而其他9个分离株(LD-1-98,LD-2-99,LD-5-01,LD-7-02,LR-3-02,LW-1-02,LG-2-00,LA-1-99和LE-1-01)基本上得不到保护(0~20%),但所有得不到保护的试验组鸡的发病死亡时间均明显向后推迟。     

新城疫病毒山东分离株F和HN基因克隆与进化分析

选取山东2007 ～ 2008年的5株NDV流行株,克隆融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因全长并测序.结果表明,5个分离株F基因长度为1662 bp,编码553个氨基酸.F蛋白裂解位点的氨基酸序列均为112 R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株F基因裂解位点的氨基酸序列特征.对F基因47 ～420 nt序列进行比对,发现4株鸡源毒株基因型为Ⅶd,另一鸽源毒株基因型为Ⅵ.5个分离株间F基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.8％～99.7％和94％～99.3％,与LaSota、Clone30、F48E9的氨基酸同源性分别为88.4％～89.5％、87.7％～88.8％、90.8％～92.4％.HN基因长度为1801bp,编码571个氨基酸,5个毒株均含13个半胱氨酸残基且位置保守.与LaSota的氨基酸同源性为87.2％～88.8％,与8个山东NDV流行株的同源性为89.8％～98.6 ％.     

鸽新城疫病毒分离鉴定

从病死美国鸽脾脏分离到１株病毒,经血凝抑制试验（ＨＩ）和电镜观察,确诊为新城疫病毒（ＮＤＶ）。采用ＳＰＦ鸡胚和ＳＰＦ鸡测定其致病指数分别为：ＭＤＴ＝６１．４,ＩＶＰＩ＝２．５３,ＩＣＰＩ＝１．６８,属于强毒株,该毒株经滴鼻／点眼途径可在９６ｈ致死６周龄非免疫鸡并出现典型的新城疫病变和症状,鸽子攻毒试验同样出现了新城疫症状和病变,超过鸽子产生高滴度的ＨＩ抗体。     

新城疫强毒河南株分离鉴定及二价油乳剂灭活苗研制

从河南豫北某蛋鸡场病死鸡中分离出1株病毒，经HA试验、HI试验、回归试验确认所分离毒株为新城疫病毒，经对分离株的MDT、ICPI的测定表明该分离株为新城疫强毒。用新城疫Lasota株和分离株制备成新城疫二价油乳剂灭活苗．在河南一些种鸡场和蛋鸡场应用，获得了满意的效果，有效地控制了新城疫的发生和流行。     

两株鸡新城疫病毒强毒株的分离与分子鉴定

从上海市发病鸡群中分离到两株新城疫病毒(NDV),其MDT分别为51.2 h和50.4 h,ICPl分别为1.850和1.875,均为强毒株.用RT-PCR扩增F基因cDNA片段,并将其分别克隆到pGEM-T easy载体中.序列分析结果表明,两分离株的F基因片段均为1 654 bp,编码551个氨基酸,其F蛋白的氨基酸序列同源性达100%,但与常见疫苗株的氨基酸同源性仅为78.3%～83.7%.F蛋白裂解位点序列均为112R-R-O-K-R-F117,属于基因Ⅶ型NDV.     

猪源性新城疫病毒的分离与鉴定

从猪身上分离到NDV AS株,其HA和HI效价均为1∶5 124,ELD50/0.1 ml为10-6.0。     

鸽新城疫病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从疑似鸽新域疫病鸽群中分离到1株病毒，该病毒株能凝集鸡红细胞，这种凝集作用能被抗新域疫病毒阳性血清抑制。血凝素热稳定指数为1min，具有快速血凝素的解脱率，病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶、盐酸(pH5.0)敏感，0.1％甲醛溶液能完全灭活病毒。分离株经肌肉注射能使鸽发病和死亡，出现与自然发病鸽一致的症状和病变。对该分离株作进一步生物学特性鉴定，鸡胚平均死亡时间(MDT)为74．6h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1．53。结果表明本分离株为强毒型鸽新域疫病毒。     

新城疫病毒的分离与鉴定

[目的]对活禽市场进行新城疫病毒的流行病学调查.[方法]从活禽市场采集40份鸡泄殖腔棉拭子,由SPF鸡胚扩增病毒,收集病毒尿囊液;采用RT-PCR技术扩增新城疫病毒的DNA,并测序.[结果]共分离出4株新城疫病毒.通过对分离株F蛋白的氨基酸序列分析发现,分离株裂解位点附近的氨基酸残基组成均为112ERQERL117,符合新城疫病毒弱毒株裂解序列特征,而且分离到的NDV之间具有较高的同源性,介于86.3％ ～ 93.9％,并与疫苗株LaSota的F基因核苷酸序列属于同一分支.[结论]小型活禽市场中鸡携带了弱毒新城疫病毒,因此应加强活禽市场的管理.     

江西遂川地区禽流感和新城疫病毒的监测研究

[目的]了解江西遂川地区野生鹭科鸟类携带禽流感和新城疫病毒的感染情况.[方法]于2014年10月在江西省遂川地区采集鹭科鸟类的肛拭子110份、咽拭子110份,采用SPF鸡胚进行病毒分离,通过血凝试验筛选出疑似阳性样品,然后再用RT-PCR进行鉴定.[结果]在110份被检样品中,除4份样品外,其余样品的血凝效价均为0.经RT-PCR检测,所有样品禽流感和新城疫病毒检测结果均呈阴性.这表明2014年秋季江西遂川地区野生鹭科鸟类发生禽流感和新城疫病毒感染的风险较小.[结论]该研究可为了解江西各地区野生水禽禽流感和新城疫的感染情况提供基础数据.     

七彩山鸡新城疫病毒的分离鉴定与免疫保护试验

用SPF鸡胚从疑似七彩山鸡新城疫病鸡群中分离到一株病毒,进行HA及HI试验以及病毒中试验。结果表明,血凝作用可被NDV阳性血清所抑制,而不能被AIV（H9亚型）、EDS76所抑制,经ND标准阳性血清处理的病料接种的鸡胚未见死亡,证明分离毒为NDV。动物回归试验表明,分离毒肌肉注射非免疫七彩山鸡能使之发病、死亡,出现与自然病例一致的症状与病变,但肌注SPF鸡只感染,不出现临床症状。其生物学特性NHAT为快、HOT为8min、ICPI为1．73、IVPI为1．45、MDT为44h。表明该七彩山鸡NDV分离株与鸡F48E9株在生物学特性上表现出不同的特性。用分离毒株制成油乳剂灭活疫苗,分别以分离毒株和Lasota株的灭活苗免疫广西麻鸡和七彩山鸡,进行疫苗免疫效果比较和交叉免疫保护试验。结果表明,分离毒株灭活苗免疫组鸡各个时期所产生的HI抗体效价和Lasota灭活苗免疫纽鸡的抗体效价相差不明显,各组的升降规律也基本一致;Lasota灭活苗免疫七彩山鸡对分离毒株的攻击只能80％保护。而其他各免疫组的无论是对分离毒株还是F48E9株的攻击均能100％保护。说明NDV不同毒株之间的毒力和抗原性存在一定的差异。     

禽肉产品中禽流感与新城疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。     

鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为探究陕西省咸阳市某鹌鹑养殖厂的鹌鹑发病是否为禽脑脊髓炎病毒引起,采集发病鹌鹑的脑、肝脏、肠道等组织,通过鸡胚传代、RT-PCR扩增、免疫组织化学试验及动物回归试验对病原体进行分离鉴定,并对得到的序列进行同源性及遗传性分析。RT-PCR扩增结果显示,用禽脑脊髓炎病毒(AEV)特异性引物成功扩增得到大小为288bp的目的片段,与参考株的核苷酸序列相似性及氨基酸序列相似性分别为84.9%~99.3%和95.8%~98.9%;遗传进化分析结果表明,分离株与SX株位于同一分支;免疫组化试验结果显示,发病鹌鹑的脑、肝脏、肠道组织切片中存在大量的阳性棕黄色着色区域,而阴性对照没有;动物回归试验结果显示,攻毒组鹌鹑出现典型的禽脑脊髓炎(AE)临床症状,发病率55.1%,病死率100%,病理剖检发现患病鹌鹑的脑组织软化,脑半球轮廓模糊,对照组未见异常。成功分离得到1株鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒,命名为AEV XY/Q-1410株,为鹌鹑禽脑脊髓炎的诊断及预防提供理论与技术支持。     

五株鸡传染性支气管炎病毒流行株的分离鉴定

2012年1月-2014年8月,从全国多地出现传染性支气管炎发病养鸡场(户)中采集病(死)鸡气管、肾脏和腺胃进行流行病学调查。根据各地分离株与YB160株S1基因分子进化树分析,筛选出5个代表性的毒株,在SPF鸡胚中传至第5代,分别进行毒价测定、无菌检验及对SPF鸡的致病力研究。结果,所筛选出的5个流行株在SPF鸡胚传至第5代时,毒价均大于或等于106.1EID50/0.1 m L,菌检阴性,人工感染试验接种1日龄SPF鸡,可引起试验鸡出现典型传染性支气管炎症状。     

不同来源的5株新城疫病毒的分离·鉴定与基因型分析

[目的]分离鉴定不同来源的5株新城疫病毒（NDV）,并对其基因型进行分析。[方法]从江苏和广西发病孔雀、鸡、鹅群分离到5株NDV。参照文献合成1对引物P1和P2,用于扩增基质蛋白基因（M）1161nt至融合蛋白基因（F）889nt之间长约970nt的片段。用TrizolRNA试剂盒抽提5株NDV基因组,再按照Promega说明书,用上游引物P1合成F基因cDNA,合成的cDNA作为聚合酶链式反应（PCR）的扩增模板,用PCR反应扩增F基因目的片段。将所得产物进行序列测定,获得这5株NDVF基因5′端约890nt序列。采用DNAMAN软件对F基因47～420nt间的片段进行序列分析,并推导出相应的氨基酸序列。在此基础上,从GenBank中选取32个参考毒株与这5个分离株进行遗传变异分析,并绘制系统发育进化树。[结果]同源性分析比较表明,5株NDV分离株之间的差异性很小,它们之间的同源性为95.00%～97.00%,其中2株广西分离株之间的同源性为97.07%,3株鹅源分离株之间的同源性为96.43%。所有毒株F蛋白裂解区氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株裂解区位点特征。这5株NDV分离株均属于基因Ⅶ型和Ⅶd亚型。[结论]近几年流行的NDV的主导基因型为基因Ⅶ型,且来自不同宿主的毒株之间的差异性较小。     

鸡肾型传染性支气管炎病变毒株的分离和鉴定

从疑似肾型传染性支气管炎(IB)死鸡肾脏中分离到1株病毒,经鸡胚传代,到第3代,出现卷缩胚,第8代,卷缩胚达到50%。第3~8代的尿囊液经胰蛋白酶处理后对鸡红细胞可引发凝集。以琼脂凝胶沉淀试验检测,病料处理后的收获液、第3~8代鸡胚尿囊液与肾型IBV抗血清均可形成沉淀线,其沉淀线与肾型IBV阳性抗原和肾型IBV抗血清之间形成的沉淀线发生完全融合。该分离株在鸡胚病毒干扰试验中对新城疫病毒LaSota株的增殖有显著干扰作用。动物回归试验,试验鸡感染分离毒株,发病率达100%,死亡率达40%,死鸡的病理变化明显而典型。结果表明,该分离毒株是鸡肾型IBV。