家兔胚胎细胞核移植与连续移植

将发育不同时期的兔胚和移核胚的卵裂球细胞核与去核的成熟卵母细胞共同组成移核胚,通过中间受体培养和移植实验检验胚胎的发育能力。结果表明,（１）兔囊胚之前各个时期的胚胎细胞核均可使移核胚发育到囊胚;（２）胚胎极化前后的卵裂球参与组成的移核胚发育到囊胚的比例无显著差异。但极化后 ６４细胞胚的卵裂球与去核卵母细胞的融合率低于极化前的 ８细胞胚胎卵裂球;（３）兔 １６细胞胚与去核的卵母细胞组成的移核胚可以发育到期,产仔率为 ３．１６％ ;（４）兔移核胚卵裂球用于连续核移植,其后 ２ 代均可发育成囊胚,其中第 １ 代移核胚与第 ２ 代移核胚发育率相似,但显著高于第 ３ 代移核胚;（５）兔移核胚和各代连续移核胚卵裂球与去核卵的融合率无显著差异。     

冰草种子发育的解剖学研究

对诺丹冰草种子发育过程的切片进行观察和研究.合子的第一次分裂为横分裂,形成顶细胞和基细胞.接着顶细胞纵分裂,基细胞横分裂,胚胎发生属紫宛型.胚发育经过椭圆形至棒形,并出现凹陷,开始初分化直至成熟胚.部分种子出现有斜向原胚及胚囊中缺少胚的现象.胚乳为核型胚乳,胚乳细胞化始于多细胞原胚期,成熟胚乳最外层发育糊粉层.其它胚乳细胞充满淀粉粒.珠心与珠被在胚发育过程中细胞质作为营养物质被吸收、解体,细胞壁则被挤压成为一厚壁层,构成乳熟期的种皮.子房壁细胞中的大量淀粉粒在胚、胚乳的发育过程中作为营养物质被吸收.     

建阳橘柚花粉育性与授粉的荧光观察

以建阳橘柚为试材,观察花器官结构、花粉育性、授粉后花粉管生长的荧光显微动态和早期胚胎发育情况。结果表明,建阳橘柚的花为完全花,花粉染色活力为66.42%,花粉萌发率为8.68%;自花和异花授粉4h后花粉都开始萌发,授粉16h后异花授粉的花粉大量萌发,自花授粉萌发量比4h时多,但低于异花授粉,异花授粉24h后少量花粉管伸入子房中完成受精,自花授粉48h后花粉管进入子房,但并没有受精成功,自花授粉72h后可观察到少量受精成功。自花授粉胚胎在第2周观察到胚囊的空泡现象,出现早期败育;异花授粉前2周胚胎发育正常,第3周观察到部分胚囊的空泡现象。     

不同来源的山羊供核细胞对核移植重构胚发育的影响

以山羊的胚胎细胞、卵丘细胞、体细胞克隆胚胎细胞为核供体,比较了以这3种细胞为核供体得到的重构胚的体外发育能力.结果显示,以体内受精所得桑椹胚为核供体的重构胚发育能力最高,卵裂率和囊胚率分别为81.25%和25.64%以卵丘细胞为核供体的重构胚发育能力次之(79.68%,21.57%),再克隆胚胎发育能力最低(64%,12.5%),但是各组间差异不显著(P>0.05).     

紫花苜蓿不同栽培品种植株再生的研究

离体培养条件下对紫花苜蓿地方栽培品种--陇东苜蓿、和田苜蓿、准格尔苜蓿以及引进品种Rambler苜蓿植株不同部位的再生进行了研究,结果表明,不同的苜蓿品种、外植体、外源激素种类及其浓度等因素均影响着植株的再生.陇东苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率和体细胞胚形成率最高可达91.04%和63.75%;和田苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率最高可达92.05%,体细胞胚形成率最高为56.82%.这2个品种在紫花苜蓿的组织培养植株再生中是较理想的试验材料;紫花苜蓿下胚轴是理想的受体材料.苜蓿愈伤组织的诱导、体细胞胚的形成以2.0 mg/L 2,4-D处理2周为最佳;在2.0 mg/L 2,4-D 0.5～2.0 mg/L 6-BA的作用下,外植体产生愈伤组织以及进一步发育的趋势较强.对体细胞胚的发育和幼苗的形成则以2.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA的激素组合进行处理.适宜的生根培养基为1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.7%琼脂.     

冰草种子发育的解剖学研究

对诺丹冰草种子发育过程的切片进行观察和研究。合子的第一次分裂为横分裂。形成顶细胞和基细胞。接着顶细胞纵分裂。基细胞横分裂，胚胎发生属紫宛型。胚发育经过椭圆形至棒形。并出现凹陷。开始初分化直至成熟胚。部分种子出现有斜向原胚及胚囊中缺少胚的现象。胚乳为核型胚乳．胚乳细胞化始于多细胞原胚期。成熟胚乳最外层发育糊粉层。其它胚乳细胞充满淀粉粒。珠心与珠被在胚发育过程中细胞质作为营养物质被吸收、解体。细胞壁则被挤压成为一厚壁层，构成乳熟期的种皮。子房壁细胞中的大量淀粉粒在胚、胚乳的发育过程中作为营养物质被吸收。     

敖汉苜蓿授粉受精及胚胎发育过程的研究

对敖汉苜蓿的授粉受精、花粉萌发以及胚胎发育过程进行了研究.结果表明,敖汉苜蓿在人工授粉10min后花粉粒的内壁穿过外壁的萌发孔向外突出,20min时形成花粉管,1h后花粉管触及柱头,而后沿花柱道伸长.24～27h到达子房开始受精;经过受精作用胚细胞开始分裂分化,到第22d便形成了具有胚根、胚轴、胚芽和子叶的完整胚.胚的整个形成过程可分为三个阶段:球状胚形成期、子叶形成期、胚各部分发育成熟期.     

不同蔗糖浓度、供体细胞保存温度和融合温度对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

以昆明小鼠为实验动物,经过超数排卵后得到卵丘卵母细胞复合体(COCs),以卵丘细胞为核供体细胞,卵母细胞为核受体细胞进行核移植,分析比较了不同蔗糖浓度对小鼠卵母细胞去核时间、去核率及重构胚体外发育的影响,并探讨了供体细胞的保存温度和融合温度对重构胚体外发育的影响.结果表明,各蔗糖浓度组的去核率均达到100%,但3%、4...     

优化成年家兔皮肤上皮细胞核移植有关参数

以成年家兔上皮细胞为核供体,对兔体细胞核移植中孤雌激活、去核、融合、激活及重构胚发育等环节中的有关参数进行筛选和研究。证实160、200和240 V/mm电场强度时的孤雌激活率(77.78%、95.12%、97.30%)无显著差异;200和240 V/mm电场强度时的孤雌激活胚囊胚率(52.94%、48.64%)显著高于160 V/mm时(16.67%);200和240 V/mm电场强度时的重构胚融合率(82.85%、79.78%)无显著差异;200 V/mm电场强度时的重构胚分裂率(71.69%)显著高于240 V/mm时(56.56%),裂解率(6.82%)显著低于240 V/mm时(17.92%)。在纺锤体观测仪下,第一极体与纺锤体在一起或相距较近的占60%左右。原核明显的重构胚的分裂率(91.75%)极显著的高于观察不到原核的重构胚(42.86%)。重构胚体外培养发育囊胚率(24.39%)低于受精卵原核胚的体外培养的发育率(86.05%),但两者同自然交配体内发育的囊胚的细胞数(81±17)差异不显著。将646枚2~4细胞重构胚移植到38只同期化或非同期化的受体后没有幼仔出生。     

桑树雄核初始发育的细胞学研究

烟草、小麦、水稻等作物利用花药和花粉培养对雄核发育细胞学的研究已有报道［１～５］。桑树花药培养虽已获得单倍体植株［６］,但对于桑树花药培养中的雄核发育过程迄今未见详细的研究。我们曾进行过初步实验［７］,但因桑树花粉启动分裂的诱导率较低而难以观察。本文将单核发育早期的花药,在加入吲哚丁酸的培养基上培养,大大提高了花粉细胞启动分裂的频率,因而详细地观察到了桑树雄核发育中的各种途径及现象。*１　材料与方法选用鲁桑系（ＭｏｒｕｓｍｕｌｔｉｃａｕｌｉｓＰｅｒｒ）“木孛椤”桑品种开放前的雄花穗（镜检小孢子发…     

影响核移植后小鼠重构胚存活因素的研究

将不同类型的供体细胞(卵丘细胞、心肌细胞和上皮细胞)的遗传物质注射到去核的MⅡ卵母细胞中,获得各种重构胚胎,以分析对小鼠卵母细胞进行核移植操作获得重构胚过程中的各种影响因素。结果表明,用Gi emas染料将挤出的卵母细胞质染色证实,可以完整地去除MⅡ卵母细胞核。对370个MⅡ卵母细胞进行去核,去核成功率为92.4%,注核成功率为82.1%;给予90 v/mm,80μsec,1次电脉冲刺激,融合率为72.1%;将融合激活后的重组胚转入KSOM培养基中,平均囊胚率达到35.8%。在胚胎重构过程中,出现了核仁显著变大,出现不同数量核仁的现象。通过比较各种重构胚胎体外后续发育,结果卵丘细胞重构胚胎的体外发育率最好。     

敖汉苜蓿授粉受精及胚胎发育过程的研究

对敖汉苜蓿的扔粉受精、花粉萌发以及胚胎发育过程进行了研究。结果表明,敖汉苜蓿在人工授粉１０ｍｉｎ后花粉粒的内壁穿地外壁的萌发孔向外突出,２０ｍｉｎ时形成花粉管,１ｈ后花粉管触及柱头,而后沿花柱道伸长。２４～２７ｈ到达子房开始受精;经过受精作用胚细胞开始分裂分化,到第２２ｄ便形成了具有胚根、胚轴、胚芽和子叶的完整胚。胚的整个形成过程可分为三个阶段：球状胚形成期、子叶形成期、胚各部分发育成熟期。     

体细胞核移植生产转基因牛胚胎的研究

为了优化利用体细胞核移植生产转基因牛早期胚胎的体系,以携带绿色荧光蛋白-新霉抗性双标记基因的pMSCV质粒转染的胎牛耳成纤维细胞为供体,以体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚,研究供体细胞的传代次数对转基因胚的影响和重构胚在不同电场条件下（电场强度、直流电脉冲次数）融合效率及其在不同体外培养系统中的发育效果。结果表明：传代5次的细胞做核供体较有利于转基因胚的发育;在电场条件为电场强度1.6 kV/cm、直流脉冲1次的融合率最高;负压单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率较好,与未转基因体细胞核移植胚的发育相比无显著差异（P〉0.05）。     

供体细胞对绵羊转基因体细胞克隆胚胎体外发育影响的研究

研究比较了转入不同外源基因、转同一基因的不同细胞克隆、供体细胞的培养代数及冷冻对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育的影响,旨在为进一步探寻建立供体细胞个性化准备方案,为提高动物克隆效率提供参考。结果表明,转不同外源基因的供体细胞对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育无影响;转同一基因的不同细胞克隆对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育有一定影响,且转TERT基因的不同克隆间的重构胚的融合率及囊胚率差异显著(P0.05)。随着供体细胞培养代数的增加,重构胚体外发育的桑葚胚率及囊胚率无显著影响,但融合率随着培养代数的增加有上升趋势,且差异显著(P0.05);供体细胞冷冻可促进其融合率、桑葚胚率及囊胚率。研究结果表明,供体细胞的不同克隆、培养代数、冷冻等因素对转基因效率有一定的影响。     

甘肃野生草地早熟禾种质资源无融合生殖鉴定分析

以甘肃省8个地区的野生草地早熟禾和商用品种‘午夜2号’为试验材料,通过纸上萌发法统计多胚苗率,利用石蜡切片技术统计无融合生殖率,并探究两者之间的相关性。结果表明:参试草地早熟禾材料的多胚苗率为0～15.29%,其中最高的是陇南,最低的是甘南,二者差异显著;无融合生殖率最高的是陇南,可达到71.04%,最低的是甘南,仅为11.2%,其他种质的无融合生殖率差距比较小,为32%～58%;相关性分析表明,多胚苗率与无融合生殖率存在显著相关性(R~2=0.96),该研究结果可为草地早熟禾无融合生殖材料筛选、种植栽培及其遗传育种提供一定的技术参考。     

供体细胞培养处理方法对水牛核移植效果的影响

以经常规培养法 (DMEM 10 % FCS)、血清饥饿法 (DMEM 0 .5 % FCS培养 5～ 10 d)和 Apidicolin- APD结合血清饥饿法 (0 .1mg/ L APD培养 2 4 h,DMEM 0 .5 % FCS培养 1～ 18d)培养处理的水牛卵巢颗粒细胞和水牛成体耳部成纤维细胞作供核 ,分别采取带下注核法和胞质内注核法进行核移植。同一供核细胞各处理组间的核移植胚融合率 (以颗粒细胞作供核 )以及重组胚的囊胚发育率无明显差异 (P>0 .0 5 ) ,但经 APD 0 .5 % FCS培养处理供体细胞核移植后的分裂率显著高于其他组 (P<0 .0 5 )。用 7%乙醇处理的成体耳部成纤维细胞进行核移植 ,其重组胚的分裂率和囊胚发育率与对照组 (不含乙醇 )均无明显差异 (P>0 .0 5 )。结果表明 ,(1)血清饥饿处理水牛供体细胞对其核移植效果没有影响 ;(2 ) DNA合成抑制剂 APD结合血清饥饿培养处理水牛颗粒细胞和成体耳部成纤维细胞 ,可提高其核移植效果 ;(3)乙醇预激活处理水牛成体耳部成纤维细胞 ,对其核移植效果没有影响     

融合液浓度梯度融合法提高延边黄牛体细胞克隆效率

延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,采用0.28mol/L蔗糖、甘露醇融合液。比较融合液浓度梯度融合法与普通融合法对延边黄牛体细胞克隆效率的影响。实验1,探讨0.28mol/L蔗糖融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(92.98%vs88.55%)、卵裂率(91.07%vs80.96%)、囊胚发育率(40.06%vs30.19%)均显著高于普通融合法。实验2,探讨0.28mol/L甘露醇融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(91.22%vs84.89%)、卵裂率(88.02%vs80.42%)、囊胚发育率(39.51%vs29.19%)均显著高于普通融合法。结果表明无论蔗糖还是甘露醇融合液,融合液浓度梯度融合法均能有效提高延边黄牛体细胞克隆效率。     

聚合嵌合法制作黄牛和水牛种间嵌合胚的初步研究

通过聚合嵌合法初步建立一套黄牛和水牛种间嵌合的程序与方法。聚合嵌合法采用链酶蛋白酶消化透明带或用机械剥离法去除透明带，然后在含有100 μg/ml PHA的培养液中聚合形成嵌合胚。结果发现， 8-细胞黄牛胚胎聚合水牛桑椹胚与黄牛囊胚聚合水牛桑椹胚相比，聚合胚存活率和囊胚发育率均无显著差异（P>0.05）。采用显微手术法分离黄牛和水牛8-细胞胚胎卵裂球进行聚合，聚合率为92.3%，囊胚发育率为58.3%，与用0.25%链酶蛋白酶分离胚胎卵裂球进行胚胎聚合的聚合率（86.7%）和囊胚发育率（46.2%）均无显著差异（P>0.05）。以上结果表明：①水牛和黄牛胚胎通过卵裂球聚合获得的种间嵌合胚胎能继续发育；②胚胎聚合前的发育阶段对其聚合成功率和随后的胚胎发育无明显影响。③胚胎卵裂球的分离方法（显微手术法和酶消化法）对其聚合率和囊胚发育率无明显影响。     

牛体外受精胚胎细胞核移植的实验研究

将采自肉联厂屠宰车间的牛卵巢中的卵母细胞置于ＴＣＭ－１９９＋１０％ＥＣＳ（０ｄ）＋ＦＳＨ（１万ＩＵ／Ｌ）＋ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）中培养成熟，用含０．３％透明质酸酶的消化液将卵母细胞周围的卵丘细胞去掉，并以７．５ｍｇ／Ｌ的ＣＢ液处理后，用微吸管吸去透明带内的第一极体及极体下面的部分卵母细胞质，然后将经体外受精并发育至８～１６细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙中，再将移核胚置于电融合槽内进行融合（电场强度为１２００Ｖ／ｃｍ，持续时间为８０μｓ，１次脉冲刺激）。将融合的胚胎移入生长有单层贴壁颗粒细胞的发育培养液（ＴＣＭ－１９９＋１０％牛血清）中培养，观察移核胚的融合率及发育率，部分去核卵母细胞经染色后观察去核率。结果表明：（１）移核胚的融合率为８６．９％（５３／６１）；（２）发育至２～８细胞期的胚胎占培养的移核胚胎总数的２１．３％（１０／４７）；（３）卵母细胞的去核率为６８．２％（４５／６６）。     

干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究

为探明干化的体细胞胚作为转基因苜蓿(Medicago sativa)人工种子的可行性,采用农杆菌菌株GV3101 感染苜蓿叶柄的遗传转化方法,获得转化苜蓿植株并诱导转化出苜蓿植株的体细胞胚。将成熟的子叶期体细胞胚先置于含10 mM脱落酸的胚形成培养基BOi2Y中培养14 d,然后将胚置于一系列的6种干燥剂中缓慢干燥7 d,最后将胚转到1/2MSO萌发培养基中,直到茎叶萌发和根形成。分析不同转基因株系干化人工种子的萌发率和再生植株中的GUS表达,并利用Southern杂交分析转基因干化人工种子再生植株的遗传变异。结果表明:干化后的转基因人工种子萌发率达到74.3%,产生的植株从形态上相似于没有干化处理的体细胞胚再生植株。在随机的3个转基因株系中,Southern杂交结果表明再生植株仍能稳定表达GUS,每个株系基因整合位点一致。因此,干化体细胞胚用作转基因植物种质保藏的方法是有效可行的。