拟南芥TUA2参与ABA胁迫下的种子萌发过程

【目的】利用反向遗传学研究拟南芥TUA2与ABA途径相关基因的相互关系以及对种子萌发的影响。【方法】采用PCR、Tail PCR和RT-PCR技术对来自ABRC的T-DNA插入TUA2突变体进行插入位点的鉴定和转录活性的分析;利用转基因技术获得TUA2超表达植株;检测了含不同浓度ABA的MS培养基中各突变体和TUA2超表达植株的种子萌发;通过RT-PCR检测了突变体中ABA途径相关基因HAB、ABI1、RD22和P5CS的表达变化。【结果】突变体tua2-1和tua2-2的T-DNA插入位点均位于TUA2的启动子区,且二者的TUA2表达量均升高。在含有ABA（0.8 μmol•L-1）的MS培养基中,突变体和转基因等5个株系的种子萌发延迟,播种第5天萌发率在6%-18%,相同条件下的野生型种子萌发率为76%;ABI1和HAB在TUA2超表达体中的表达明显低于野生型,受ABA诱导后被诱导表达的程度也远低于野生型。【结论】TUA2可能参与了ABA信号途径对种子萌发过程的调节。     

拟南芥FATB蛋白的亚细胞定位

为研究拟南芥中脂酰基 ACP硫酯酶B(FATB)的亚细胞定位,采用RT PCR方法克隆FATB基因的全长cDNA,构建其与eGFP基因融合的表达载体pUC FATB eGFP NOS,分离拟南芥叶肉细胞原生质体,然后将pUC FATB eGFP NOS转入拟南芥叶肉细胞原生质体中表达,最后在荧光显微镜下检测到eGFP荧光信号定位于叶绿体上。     

拟南芥DNA_J结构域蛋白的生物信息学分析及其亚细胞定位验证

对拟南芥RSS1蛋白进行了一系列生物信息学分析,结果表明:该蛋白是一C端含有DNA_J结构域的辅助蛋白,其N端含有受体蛋白复合物AP-2结合区DPF/W和FxDxF区,中间区域含有可信度较低的丝氨酸富集区和谷氨酸富集区.该蛋白可能具有ATP结合活性、丝氨酸/苏氨酸激酶活性和磷酸酶活性,可调控细胞循环和蛋白的磷酸化和去磷酸化作用.利用洋葱表皮瞬时表达系统验证了RSS1-GFP融合蛋白定位于细胞核中,为进一步研究该蛋白的分子和生物学功能奠定了良好基础.     

拟南芥Atfin1锌指蛋白的细胞定位

[目的]确定拟南芥锌指蛋白基因Atfin1的效应部位。[方法]用Trizol提取拟南芥叶片的总RNA,根据GeneBank数据库中Atfin1cDNA全序列设计引物,进行Atfin1的PCR扩增,克隆Atfin1基因,并进行同源性比较,构建pBI-Atfin1-EGFP融合表达载体,对Atfin1进行定位。[结果]克隆得到的拟南芥Atfin1蛋白氨基酸序列同紫花苜蓿Atfin1蛋白氨基酸序列的同源性达78.60%,在接近C-末端区域形成锌指结构的8个氨基酸残基高度保守,与周围的氨基酸残基共同形成典型的C4HC3基序。融合有Atfin1的绿色荧光蛋白只在细胞核区域表达,而未做融合的绿色荧光蛋白在整个细胞内呈弥散状分布。Atfin1没有典型的核定位信号,但仍然能够准确地在细胞核内表达。[结论]Atfin1在细胞核内表达,符合作为转录因子的表达特征。     

联合双基因表达载体的构建及其拟南芥转化

[目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3)基因以及基因上游启动子的DNA序列:CP-CBF3,共2 075 bp。CP是CBF3基因的启动子,受低温诱导。用EcoRI和BamHI双酶切CP-CBF3并置于植物表达载体pCAMBIA1300中,构建CBF3基因冷诱导表达载体pCA-CP-CBF3。然后将带有组成型启动子的肌醇半乳糖苷酶基因AtG-loS3合并于pCA-CP-CBF3中,构建双基因植物表达载体pCA-CP-CBF3-35S-AtGloS3。用真空抽滤虑法将这两个表达载体转化到拟南芥中,并用潮霉素筛选出转基因植物苗。[结果]CBF3和AtGloS3基因均来自拟南芥,而CBF3不存在内含子,AtGloS3基因存在内含子,故以CB-1、CB-2为引物的非转基因植物中也能得到带,而以AT-1、AT-2为引物的非转基因植物不能得到带。[结论]该研究中pCA-CP-CBF3是1个对照,实验的后续工作需进一步进行。     

拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C(AT1g07430)的cDNA序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法从NaCl处理的拟南芥总RNA中扩增出AtPP2C基因的全长cDNA片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR201中。测序表明,该片段与GenBank上报道的序列具有100%的同源性。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pLEELA为基础,构建了由组成型启动子35S调控的AtPP2C基因的植物表达载体pLAT35S。     

基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF基因表达载体的构建

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位分析

为明确拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位情况,本研究构建了AtPLC2基因融合GFP标签的表达载体35S:PLC2-GFP,并通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化本氏烟草叶片,转基因烟草叶片细胞利用激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光信号与细胞质膜重合,表明拟南芥AtPLC2基因定位于细胞质膜上,研究结果为明确拟南芥AtPLC2基因的功能奠定了良好的基础。     

拟南芥细胞分裂素受体AHK3亚细胞定位信号的研究

【目的】研究细胞分裂素受体在细胞内定位分布的具体信号及其机制。【方法】构建拟南芥细胞分裂素受体蛋白——组氨酸蛋白激酶3(Arabidopsis histidine kinase 3,AHK3)的一系列亚细胞定位相关表达载体,转化到拟南芥原生质体细胞中进行瞬时表达后,采用激光共聚焦显微镜观察研究AHK3的亚细胞定位信号。【结果】AHK3定位于内质网(Endoplasmic reticulum,ER);AHK3的N端和C端均含有ER定位序列。【结论】AHK3在ER中实现对细胞分裂素的感知及受体蛋白之间的相互应答,并进行下游的信号转导;AHK3含有多段ER驻留信号。     

拟南芥MDH2基因GFP载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]以野生型拟南芥为材料构建MDH2基因GFP载体及GFP转基因植株,研究MDH2基因在植物响应镉胁迫机制中的功能。[方法]通过提取野生型拟南芥的RNA,反转录成为cDNA,并以cDNA为模板,利用PCR扩增MDH2基因,将扩增所获得MDH2基因和pXB94-GFP质粒双酶切后连接,并转化进大肠杆菌感受态细胞中,鉴定正确后再转入农杆菌感受态细胞中,通过菌落PCR鉴定出阳性单菌落。再通过浸花法转入野生型拟南芥中,最后利用抗性筛选和PCR鉴定获得MDH2转基因阳性植株。[结果]成功克隆MDH2基因,并构建了MDH2-GFP重组质粒,抗性筛选获得了MDH2-GFP转基因植株。[结论]成功获得MDH2-GFP转基因植株,为进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础。     

拟南芥AtCCaP2基因缺失突变体的鉴定及表型观察

本研究拟利用反向遗传学研究AtCCaP2基因的功能。通过PCR及RT-PCR的方法筛选和鉴定了拟南芥AtCCaP2基因的T-DNA插入突变纯合体atccap2,该纯合体AtCCaP2基因表达缺失。RT-PCR分析显示该基因在拟南芥雌雄蕊等生殖器官中有较多的表达。通过对生长表型的观察发现atccap2突变体出现早花现象,抽薹时间较野生型早3d,显示该基因可能参与了拟南芥的早花表型。     

拟南芥AtCpNifS克隆及其原核表达

从哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)中克隆了AtCpNifS的完整CDS序列。通过测序和序列比对分析,确认了克隆序列的完整性和正确性。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体(BL21-pET28-AtCpNifS),并从该质粒中成功分离了表达蛋白(AtCpNifS)。     

拟南芥POT基因密码子使用特性分析

运用CodonW程序对拟南芥(Arabidopsis thaliana)POT基因密码子组成、同义密码子使用频率和全长编码区密码子进行分析.结果表明,拟南芥POT基因密码子适应指数(CAI)与同义密码子第三位碱基含量(C3s)、密码子偏爱指数(CBI)均呈显著正相关(P＜0.05),与最优密码子使用频率(FOP)呈极显著正相关(P＜0.01).有效密码子数(ENC)与同义密码子第三位碱基含量(C3s)呈显著正相关(P＜0.05),与GC3s呈极显著正相关(P＜0.01),与同义密码子第三位碱基含量(T3s)呈极显著负相关(P＜0.01).拟南芥POT基因密码子使用相对概率(RSCU)＞1的密码子多以碱基A或T结尾.     

拟南芥黑芥子酶基因根特异性表达启动子的克隆

黑芥子酶是一类催化芥子油苷水解的同工酶, pyk10 是一个在拟南芥根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因。本研究用PCR方法从拟南芥Columbia生态型基因组中克隆了pyk10 基因启动子片段。序列分析表明:该片段全长1 454 bp,与已发表的pyk10 启动子序列(GenBank accession no. AJ292756)同源性达98%。该启动子片段中含有多种其他植物基因启动子中发现的通用启动子元件,并含有器官和组织特异性转录因子的结合位点ACGT-、CANNTG-、GATA-以及I盒等顺式元件。     

拟南芥ATMYB2转录因子的cDNA序列分析及其细胞定位

根据GenBank中收录的拟南芥At Myb2基因(GenBank登录号:AK229140)的cDNA序列设计1对引物,对拟南芥中叶片提取的总RNA进行扩增和克隆,并将拟南芥ATMYB2蛋白氨基酸序列进行同源性比较和蛋白定位分析.结果表明:At Myb2基因cDNA全长为816 bp,编码272个氨基酸和1个终止密码子,具有2个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区,分别为23-70、79-118位氨基酸,属于典型的R2,R3-MYB转录因子;经过氨基酸比对发现,拟南芥ATMYB2蛋白与水稻的ATMB18蛋白同源性最高,为44.60%.对拟南芥At Myb2基因进行RT-PCR扩增,结果表明基因片段未发生任何突变;通过拟南芥ATMYB2与EGFP形成融合蛋白对AT-MYB2进行了定位,发现ATMYB2蛋白在细胞核内能够表达,符合作为转录因子的表达特征.     

不同生态型拟南芥FLC基因的序列分析

[目的]对拟南芥春化作用相关基因FLC的序列分析。[方法]先期经过对拟南芥自然群体的春化反应的QTL分析,发现拟南芥5号染色体上有一个与开花有关的QTL,本实验就是运用序列分析确定它与FLC基因是否具有同源性。[结果]意大利拟南芥与瑞典拟南芥在第27位、第461位、第501位、第638位、第738位、第884位碱基上不同。虽然这些碱基有所不同,但是密码子编码出来的第9个氨基酸、第167个氨基酸、第246个氨基酸,由于密码子的简并性,编码的蛋白质均相同。[结论]拟南芥具有丰富的遗传多样性,其FLC基因序列长度高度保守、碱基变异位点丰富密码子的简并性它们均编码同一种氨基酸对拟南芥生长没有影响。这表明拟南芥的基因序列会受到环境的影响。