At2基因双T-DNA植物表达载体的构建

以甜瓜品种‘MR-1’为试材,采用PCR技术,扩增出了At2基因并在两端添加BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。结果表明:在NCBI上进行BLAST显示其氨基酸序列与GeneBank中已公布的At2基因的同源性为99%;经DNAMAN软件分析,核苷酸序列同源性为99.43%。将其连接在中间表达载体G-pPTN133上,得到替换了GUS基因的中间载体A-pPTN133。A-pPTN133再经ScaⅠ酶切后,插入到经ScaⅠ酶切的pPTN133~-中,构建成双T-DNA植物表达载体At2-pPTN133。经酶切和PCR鉴定证明了所构建载体的正确性。     

黑莓RuMYB10基因的克隆和表达

【目的】从黑莓中克隆RuMYB10的编码区全长序列,并分析其在黑莓果实发育过程中的表达情况与果实花青素苷积累的关系。【方法】以黑莓基因组DNA为模板,通过同源克隆和SON-PCR技术获得了RuMYB10基因全长编码序列(Accession No.:JQ359611);并以黑莓果实mRNA为模板进行验证。采用实时定量PCR技术检测该基因在果实不同发育阶段的表达水平。【结果】结果表明,该基因编码区全长共1 837 bp,编码216个氨基酸,推导蛋白分子质量为24 863 Da。具有MYB转录因子家族特有的R2R3保守序列。含有两个内含子,第2个内含子长度为750 bp,占全长40.8%;在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的‘[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。RuMYB10基因在黑莓果实发育后期,即果实变红到最后变黑的过程中大量表达,与花青素苷的积累相一致。【结论】从黑莓中克隆到包含完整ORF的转录因子基因RuMYB10,具有MYB因子家族结构特征和bHLH因子结合域,且在果实花青素苷积累高峰期表达量最高。     

板栗CmMYB转录因子基因的克隆及在花序发育中的表达分析

板栗大量雄花序影响产量形成,寡雄性状是板栗重要的育种目标。利用RT-PCR与RACE扩增方法,从板栗极短雄花序芽变和正常雄花序cDNA中分离出一个板栗MYB转录因子cDNA全长,进行测序和序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段总长为1 522 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1 071 bp,可编码长度为357个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与苹果的MYB91、豌豆的MYB转录因子和蒺藜苜蓿的MYB转录因子基因分别具有88%、87%和87%的氨基酸序列同源性。序列分析及空间结构预测发现该序列具有完整的R2R3区域,推测其具有转录激活功能。命名为CmMYB(GenBank登录号为GU076490)。实时荧光定量PCR结果显示,芽变雄花序CmMYB转录因子在雄花序原基形成期、花簇原基形成期、花朵原基形成期、雄蕊原基形成期和花药形成期的表达量均低于正常雄花序中的表达量,而在花被原基形成期表达量高于正常雄花序中表达量,说明该转录因子调控的主要基因与雄花序的短化存在一定联系。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

‘红肉蜜柚’CmMYB330基因的分离与表达分析

【目的】分析‘红肉蜜柚’果实汁胞粒化相关的MYB转录因子基因特征与表达模式,探讨MYB转录因子在蜜柚汁胞木质素代谢过程中的作用机制,为研究蜜柚汁胞粒化发生机制提供借鉴。【方法】以‘红肉蜜柚’果实汁胞为试材,参考甜橙MYB全基因组分析,利用生物信息学分析和PCR技术克隆Cm MYB330的编码区序列及其5’端调控序列,并对序列进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术对Cm MYB330在‘红肉蜜柚’果实汁胞不同发育时期和不同部位的表达情况进行分析。利用农杆菌介导法将Cm MYB330与GFP的融合表达载体注射转化到烟草叶片中进行亚细胞定位分析。利用酵母双杂交系统对Cm MYB330进行转录激活活性分析。【结果】Cm MYB330的编码区序列长度为942 bp,编码313个氨基酸,预测为核定位蛋白,为典型的R2R3 MYB转录因子。Cm MYB330与甜橙Cs1g19400.1、Am MYB330等亲缘关系近,都属于R2R3 MYB第4亚组。Cm MYB330的5’端调控序列为起始密码子上游-1 748 bp序列,预测该序列含有TATA-box、CAAT-box 2个启动子核心元件,3个MBS,1个AC-I,1个5UTR Py-rich stretch,还有大量激素(如赤霉素、乙烯、水杨酸等)响应元件。Cm MYB330表达量在‘红肉蜜柚’果实汁胞发育过程中有起伏,但总体呈现上升趋势,表达量在花后208 d达到最大,之后开始下降。在转化p-super1300-Cm MYB330-GFP的烟草叶片细胞核中检测到绿色荧光信号,与预测结果一致,说明Cm MYB330定位在细胞核中。在Y2H Gold酵母中,Cm MYB330表现为没有转录激活活性。【结论】克隆了‘红肉蜜柚’MYB转录因子Cm MYB330编码区序列及其5’端调控序列,Cm MYB330属于R2R3 MYB第4亚组,与汁胞粒化相关,为核定位蛋白,同时分析了其在‘红肉蜜柚’果实汁胞发育过程中的表达水平,总体呈上升趋势。为进一步研究Cm MYB330与蜜柚汁胞粒化的关系奠定了基础。     

苹果属小金海棠转录因子MxMYB1基因的克隆及其原核表达

 MxMYB1是苹果属小金海棠MYB类转录因子。MxMYB1含1个重复序列及MYB蛋白特有的氨基酸组成。酶切、PCR扩增及测序分析表明构建的原核表达载体结构正确, 未出现碱基突变及移码现象。1 mmol/L IPTG诱导2 h后, 在预期的蛋白分子量38 kD处出现1条表达加强的蛋白条带, 而未经诱导的转化子没有此蛋白条带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础。     

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因植物表达载体的构建

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)是危害中国葫芦科作物主要病毒之一。试验以该病毒中国分离物外壳蛋白基因的克隆载体pZCP-87(含ZYMV的CP基因)为材料,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切,从胶上回收目的基因,与经过同两种酶酶切的植物表达载体pBIN438连接,转化感受态的大肠杆菌细胞,提取质粒,经PCR和SalⅠ/BamHⅠ双酶切验证,已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上(重组质粒命名为pBZCP5),采用冻融法完成了对pBZCP5质粒的农杆菌转化。该工作是通过转基因获得抗ZYMV病毒研究的基础。     

黄秋葵盐胁迫下的转录组分析

以黄秋葵(Mesembryanthemum crystallinum L.)品种助农2号为试材,利用Illumina HiSeq TM2500高通量测序技术研究黄秋葵在400 mmol · L~(-1) NaCl胁迫下转录组基因的差异表达。结果表明,黄秋葵幼苗盐胁迫处理和对照24 h后地上部分共获得70.17 Gb有效数据,Q30碱基百分比均在93.21%以上;共获得1?396个差异表达基因(DEGs),包括588个上调基因,808个下调基因,其中功能注释的基因有1?266个。根据Unigene库序列进行GO、KOG和KEGG注释,植物体内抗氧化及活性氧清除相关基因—过氧化物酶55基因、超氧化物歧化酶基因、谷胱甘肽S-转移酶基因、4-羟基肉桂酸基因、黄酮醇合成酶基因、查尔酮合成酶基因,植物生长发育相关基因—WRKY21 转录因子基因、ERF2 转录因子基因、NAC29 转录因子基因、GATA22 转录因子基因、MYB4 转录因子基因、生长素响应蛋白基因,植物渗透调节相关基因—海藻糖-磷酸酶基因、磷酸乙醇胺N-甲基转移酶1基因,均上调表达。     

川芎甜菜碱醛脱氢酶cDNA的克隆及其植物表达载体的构建

以川芎为试材,从叶片中提取总RNA,经过RT-FCR获得甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogenase)基因的cDNA,纯化后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌Top10,获得甜菜碱醛脱氢酶全长基因序列,以期构建植物表达载体.结果表明:甜菜碱醛脱氢酶全长核苷酸长度为1 527 bp,编码508个氨基酸.与GenBank中已发表序列HM35276进行比较,核苷酸同源性为100％.将该基因片段克隆到植物表达载体pBI121中,构建重组质粒pBI121/Betaine aldehyde dehydrogenase,并将所获重组质粒经过双酶切和PCR处理后进行序列测定,证实表达载体上含有目的片段,且连接、构建正确,为BADH的进一步表达奠定了基础.     

双价抗病虫基因植物表达载体Lc-ChiA pBI121的构建

采用35S启动子将抗病基因玉米Lc转录因子和抗病虫基因棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)的几丁质酶(ChiA),连接到高效植物表达载体pBI121中,进行酶切鉴定。结果表明:含有上述2个基因,且转录方向相同的双价植物表达载体已经构建成功;含有上述2个基因的双价载体国内外尚未见报道,用于植物转基因研究,可提高植物抗病虫害能力。     

花青苷生物合成转录调控研究进展

 花青苷生物合成由一系列结构基因编码的酶催化完成,而结构基因的表达受MYB、bHLH 和WD40 这3 类转录因子组成的MBW（MYB-bHLH-WD40）转录复合体的协同调控。花青苷合成的转 录调控研究最先在30 多年前见于玉米、拟南芥和矮牵牛等模式植物,近年来在肉质果实上也取得了重要 进展。在介绍果实花青苷的种类、分布与功能的基础上,回顾了MYB、bHLH、WD40 这3 类转录因子 的基本特性及其在花青苷合成调控中的作用,进而就MBW 转录复合体协同调控果实花青苷生物合成的 机制研究的近年进展进行了综述。     

NaCl、蔗糖和KH_2PO_4对红叶桃离体叶片花色苷合成基因表达的影响

为探明外源化学物质对红叶桃叶片着色的影响及其机制,以‘筑波5号’离体叶片为试材,研究不同浓度NaCl、蔗糖及KH_2PO_4处理对叶片中花色苷生物合成途经相关基因表达水平的影响。结果显示:低浓度NaCl(100和200 mmol′L~(-1))短时间(4 h)处理能提高花色苷合成结构基因CHI、UFGT和转录因子基因MYB10、bHLH33的表达水平;0.3%蔗糖处理8 h对UFGT、MYB10和bHLH33的表达促进作用显著;0.2%KH_2PO_4处理8 h对CHI、UFGT、MYB10、bHLH33和WD40的表达也具有显著的促进作用,而且CHI的表达在一定范围内随蔗糖及KH_2PO_4浓度增大和处理时间延长,效果更明显。除了0.2%KH_2PO_4处理8 h提高了WD40的转录外,NaCl、蔗糖及KH_2PO_4对MYB15和WD40的表达均具有显著抑制作用。     

垂丝海棠MhMYB114-Like的克隆及其在苹果愈伤组织中的抗缺铁功能鉴定

从苹果砧木垂丝海棠(Malus halliana Koehne)中克隆得到了Mh MYB114-Like基因(序列号:LOC103405832)。该基因包含全长为602 bp的完整开放阅读框,编码200个氨基酸,蛋白质等电点为9.38。系统进化树分析表明,Mh MYB114-Like与野草莓该家族蛋白亲缘关系最近。分析Mh MYB114-Like的启动子区域发现包含干旱、光、生长素和黄化响应等顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,在缺铁胁迫下Mh MYB114-Like在垂丝海棠叶和根中表达水平显著上升,Mh MYB114-Like的表达明显受缺铁胁迫的诱导。将Mh MYB114-Like遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,通过测定相关生理指标进行抗性分析发现,过量表达Mh MYB114-Like可明显提高转基因愈伤组织对缺铁胁迫的抗性。结果表明Mh MYB114-Like可响应缺铁胁迫,在抵抗缺铁胁迫中具有重要作用。     

辣椒MYB基因家族的鉴定及与辣味关系分析

利用生物信息学方法从辣椒全基因组数据库中筛选出172个MYB转录因子,并对其序列特征、染色体定位、进化关系、蛋白质保守基序和基因结构等进行综合分析,同时通过辣椒果实不同发育阶段胎座组织转录组测序筛选与辣味可能相关的MYB基因。结果表明,辣椒MYB有1R、2R（R2R3）、3R、6R等类型,其中R2R3型居多,结构域分析表明其具有典型的W型R2R3保守基序;获取20个motif元件并进行位置分析,发现同一支MYB蛋白具有相似的结构特征;进一步与拟南芥聚类得到37个类群,推测具有多种生物学功能。转录组测序发现,CaMYB98、CaMYB168等12个MYB表达量符合‘黄魔王’辣椒果实胎座组织在不同发育期的辣椒素含量变化规律,推测其可能通过特异位点的结合来上调或下调相关蛋白的表达,从而达到对辣椒素代谢路径的调控,可作为辣味调控的重要候选基因进一步研究。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

换锦花LsMYB4基因的克隆与表达分析

以换锦花（Lycoris sprengeri）为材料,采用RT-PCR方法和RACE技术相结合的方法,从花瓣中克隆了MYB基因的cDNA全长序列,命名为LsMYB4。该序列全长793 bp,包含606 bp完整开放阅读框,编码201个氨基酸,具有明显的R2R3-MYB结构域,与中国水仙NtMYB相似性达96%。实时荧光定量PCR分析结果表明,LsMYB4在换锦花不同组织和不同花期均有表达,其中在花瓣中的相对表达量比叶中多9 ~ 10倍,在盛花期的相对表达量比花苞期多20倍。不同花色无性系花瓣中表达量存在差异,花色较浅的无性系高于其它无性系,推测LsMYB4在调控换锦花花色形成的过程中起着负调控作用。     

茄子花青素合成相关基因SmMYB 的克隆与表达分析

 以茄子（Solanum melongena L.）‘YZ14’（紫茄）和‘YZ3’（白茄）为试验材料,采用 同源克隆与RACE（rapid amplification of cDNA ends）相结合的方法克隆了茄子MYB 基因cDNA 及gDNA 全长序列,命名为SmMYB。序列分析结果表明：该基因cDNA 全长1 035 bp,开放阅读框837 bp,编码 278 个氨基酸,与辣椒（Capsicum annuum L.）MYB 转录因子氨基酸序列相似性达71%;成熟蛋白的等电 点为8.47,具有2 个典型的DNA-binding 结构域且亚细胞定位于细胞核;gDNA 全长3 834 bp,包含3 个 外显子及2 个内含子。荧光半定量检测结果表明：SmMYB 在茄子根、茎、叶、花瓣、果皮中均有表达, 但表达水平具有组织特异性;遮光处理后紫色茄子果皮中该基因表达量变化与花青素合成量变化趋势相 似。推测SmMYB 为一个MYB 转录因子基因,正向调控茄子花青素的合成。     

红皮梨花青苷调控基因PyMYBa的克隆与表达分析

以红皮梨‘奥冠’为试材,采用RT-PCR结合RACE技术获得1个MYB基因,命名为PyMYBa。该基因开放读码框共714 bp,编码237个氨基酸。PyMYBa分子量27.4 kD,等电点8.78。氨基酸序列分析显示,在其N端具有保守的R2R3-MYB结构域,R3-MYB结构域含有bHLH结合基序。进化树分析表明,PyMYBa与花青苷调控MYB转录因子的同源性很高。基因表达结果表明,PyMYBa在梨叶、花、果皮中表达量明显高于果肉,果皮中的表达量与花青苷调控基因PyMYB10相比,无显著差异。遮光及MeJA处理后果皮中PyMYBa、PyMYB10的表达量变化与花青苷合成量变化趋势相似,推测PyMYBa为梨花青苷合成中重要的正向调控因子。通过原核表达试验获得了该基因的重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测结果与预期蛋白分子量一致。     

苋菜中甜菜红素代谢相关基因AmMYB2的表达与功能分析

为了研究AmMYB2基因在苋菜(Amaranthus tricolor)甜菜红素合成中的作用,对红色苋菜品种‘大红’AmMYB2(登录号为KY814751.1)进行生物信息、基因表达及功能分析。结果表明:AmMYB2的开放阅读框(ORF)全长为678 bp,编码蛋白分子质量为25.96 kD,该蛋白具有R2R3型MYB结构域,属于R2R3型MYB转录因子。核酸序列分析结果显示,AmMYB2与甜菜红素合成相关的甜菜BvMYB1和苋菜AmMYB1的相似度分别达到62.11%和49.93%。亚细胞观察显示,AmMYB2蛋白定位于细胞核。实时荧光定量(qPCR)分析发现,AmMYB2在红色苋菜品种的表达量高于绿色苋菜品种;在‘大红’苋菜中,不同组织以及叶片不同部位中AmMYB2的表达量与甜菜红素含量成正比。构建AmMYB2过表达载体,将其转入烟草和拟南芥中,发现该基因能够在这两种植物中高水平表达,但不会引起颜色变化,揭示AmMYB2可能是苋菜中甜菜红素合成的正调控因子,可能不参与花青素的合成。