新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达

【目的】研究克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]PGIP基因并进行原核表达,探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段连接到原核表达载体pET30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】序列分析表明,新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为MsPgip,GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD,等电点为7.05,有6个潜在的N-糖基化位点,信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序(LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRN-KLTGHIPIS)。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYBIO基因的克隆、序列分析及原核表达

目的：克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f．neiclzwet-zkyana（Dieck）Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。     

银杏GinNdly基因的植物表达载体构建

未知功能的植物基因一般需要通过转基因植物来研究和验证。银杏(Ginkgo biloba L．)是一种童期很长的古老植物，LEAFY基因是一个花分生组织特征基因，调控着植物开花的时间。用植物双元表达载体质粒pCAMBl-Al301构建了开花基因，LEAFY的银杏同源基因GinNdly的反义与正义植物表达载体。因pCAMBlAl301质粒的多克隆位点处没有启动子和终止子，将pB1121的35S启动子和nos终止子引入该质粒。通过PCR检测和酶切验证，证明质粒构建正确，为研究银杏花分生组织特征基因GinNdly奠定了基础。     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

红肉苹果冷信号基因MdICE1的表达及其蛋白与MdMYB的互作

根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因（MDP0000662999）,暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24 ℃下的愈伤组织相比,低温（8 ℃）诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性

 根据已报道的植物铁结合蛋白基因( ferritin) 的保守区域设计引物, 用RT2PCR 的方法从‘嘎拉’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因cDNA共有1 043个碱基, 其中编码区834bp, 编码277个氨基酸残基的蛋白质, 终止密码子后有209 bp左右的3’端尾随序列区。Southern杂交结果显示ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5 mmol·L ^{- 1}的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗不同时间后的定量RT-PCR分析表明, ‘嘎拉’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达量增加, 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。     

红肉苹果愈伤组织生长素信号相关基因MdARF3的克隆与表达分析

以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’F_1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,初步探讨生长素调控苹果花青苷代谢机理。根据拟南芥AtARF3蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到一个生长素信号相关基因(MDP0000173151),暂命名为MdARF3。克隆测序发现该基因的开放阅读框长度为2 127 bp,编码708个氨基酸。进化树分析表明,MdARF3与AtARF3在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。愈伤组织在含有0.3 mg·L~(-1) NAA的MS培养基培养2 h之后其MdARF3上调表达,表达量极显著高于无NAA培养基(对照),而CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT及LDOX等花青苷合成结构基因的表达量均极显著低于对照,并且MdARF3表达量与培养基中NAA浓度呈显著正相关(相关系数为0.98),与愈伤组织花青苷含量呈显著负相关(相关系数为–0.89),推测MdARF3对培养基中生长素快速做出反应调控花青苷合成;通过原核诱导获得了MdARF3的重组蛋白,为进一步研究MdARF3蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

番茄花药特异表达启动子LAT52的克隆与表达载体构建

采用半巢式PCR方法,从番茄基因组中扩增出了花药特异表达启动子LAT52。该序列与GenBank公布的同源序列相似度达98％,并鉴别到一个TAAAAAA简单重复序列。     

柑橘冷诱导基因及其启动子表达载体构建与瞬时表达分析

【目的】以YFP为报告基因,构建柑橘冷诱导基因及其启动子的植物表达载体。【方法】克隆获得枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8,柠檬中同源基因Clcor8及其启动子p Clcor8;双酶切含启动子的克隆载体和植物表达原始载体p1D4,连接获得含启动子的中间载体;再双酶切含冷诱导基因的克隆载体和中间载体,连接后获得重组质粒;通过冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。【结果】构建了p1D4/p Ptcor8-Ptcor8::YFP,p1D4/p Ptcor8-Clcor8::YFP和p1D4/p Clcor8-Ptcor8::YFP 3个融合表达载体,瞬时表达发现3个融合基因均可在冰糖橙叶片中表达。【结论】3个融合表达载体的成功构建为下一步转化柠檬,分析枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8的功能奠定了基础。     

矮牵牛ACS2基因的克隆及反义重复表达载体的构建

利用降落PCR的方法,从矮牵牛DNA中扩增出ACS2基因片段,在GenBank中获得基因序列号为DQ090003;利用一步法将ACS2基因的反义重复与pBI-121质粒连接,构建含该基因的反义重复表达载体.     

来自苹果的SSRs在蔷薇科植物资源上的通用性分析

 用来自苹果基因组的6个SSR标记(CH02a10、CH02b07、CH02c11、MS01a03、CH01f12和CH03d11) 引物, 对蔷薇科植物的6属19个种的基因组DNA进行了PCR扩增, 以分析其在不同物种上的通用性。结果表明, 这些SSR引物几乎在所有的供试物种上都能扩增出与在苹果上大小相似的SSRs产物。可见, 这些从栽培苹果上开发的SSR引物可用于蔷薇科内更多跨种、跨属的种质资源的研究。但不同的SSR标记所表现出的多态性有较大差异。对本研究所用的几个SSR标记来说, CH01f12在供试物种间呈现的多态性最高。     

红肉苹果组织培养及转基因体系的建立与优化

于早春取红肉苹果植株上当年生茎段,建立其组织培养体系,并对其组织培养体系进行优化.结果表明:在添加0.2 mg/L IBA+-1.0 mg/L TDZ的MS培养基上红肉苹果叶盘不定芽诱导率最高,再生率为100％,平均每个叶盘再生9.57个不定芽;1 mg/L IBA+I mg/L BAP组合有利于植株扩繁,其扩繁率为8.27;添加0.6mg/L IBA的培养基上的生根率最高,为93.3％.转基因测试结果表明,农杆菌菌株EHA105适于红肉苹果的基因转化;农杆菌浸染后进行3d的共培养有利于转化效率的提高.     

高温对平邑甜茶幼苗生物发光与能量代谢的影响

 以平邑甜茶[Malus hupehensis (Pamp) Rehd. var pingyiensis Jiang]当年实生苗为材料,研究了高温胁迫对幼苗生物发光的影响以及ATP含量、总呼吸、抗氰呼吸等的变化。结果表明,高温胁迫初期,平邑甜茶幼苗叶片超弱发光和荧光强度均下降,但随着高温胁迫时间的延长,两者均逐渐回升,并在48h时基本恢复到对照水平;但叶片磷光强度在高温胁迫的48h内一直逐渐升高;高温胁迫下,叶片的总呼吸速率降低,抗氰呼吸速率升高,同时ATP生成量也明显降低,显示高温胁迫下平邑甜茶叶片的生物发光与呼吸途径和能量代谢的改变密切相关。     

三裂叶海棠分类地位的研究

 根据三裂叶海棠分类研究的新进展, 采用系统发生􀀂 植物地理学的理论和方法,探明三裂叶海棠与苹果属的原始种( 老挝林檎) 是同源区系解体后独立演化的, 是其亲缘关系极为密切的近缘属植物, 起源于白垩纪, 命名为独模属。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

平邑甜茶后代双胚苗的倍性鉴定及核型分析

为了确定平邑甜茶双胚苗的倍性特征和核型特点,采用压片和流式细胞仪观测的方法对平邑甜茶后代中双胚苗进行染色体倍性观察和核型分析。结果表明:4株供试材料均为三倍体,2n=3x=51,染色体为小型,染色体长度比差异不大;核型组成由中部着丝点染色体(m)和亚中部着丝点染色体(sm)组成;株系8-1、8-2、12-1和12-2的核型公式分别为2n=3x=45m+6sm,2n=3x=48m+3sm,2n=3x=27m+24sm,2n=3x=33m+18sm;染色体相对长度和着丝点指数的变异范围分别为1.21%～2.68%和34.19%～42.37%,1.44%～2.63%和35.59%～44.08%,1.36%～3.02%和32.85%～42.18%,1.43%～2.87%和34.23%～44.02%;核型分别属于1B、1A、2B和1B类型,表现为株系之间的核型不完全相同。本研究为丰富无融合生殖型砧木的育种理论,获得新的苹果无融合生殖型砧木提供有益的借鉴。     

八棱海棠肌动蛋白基因(MrACT)的克隆及分析

以八棱海棠(Malus micromalus Makino)为材料,抽取RNA,反转录成cDNA。采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法,5’-RACE获得长度1121bp的片段、3’-RACE获得883bp的片段,再通过设计引物扩增得到八棱海棠中一种肌动蛋白基因的cDNA的全长序列。该序列全长1134bp,推测其编码377个氨基酸,等电点为5.16,其编码的氨基酸与拟南芥(Arabidopsis thaliana)actin7编码的氨基酸只有2个氨基酸差别。通过对八棱海棠MrACT基因的表达分析,发现在不同组织中,该基因的表达水平没有明显差异,本文为进一步利用RT-PCR技术,以MrACT基因为内标,研究八棱海棠其他基因的丰度打好基础。     

中国芦荟AlDREB2基因的克隆及其胁迫表达

 为了研究中国芦荟的抗逆机理, 以cDNA为模板, 利用3′RACE和PCR扩增方法, 克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因, 命名为AlDREB2, GenBank登录号为FJ560460。其cDNA序列全长为886bp, 包含一个636 bp的开放阅读框, 推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸) 与库拉索芦荟AlDREB1的序列相似性很高。进化树分析结果将AlDREB2 归入DREB 亚家族中A26亚组。利用RT-PCR 技术分析了AlDREB2 基因的表达与胁迫的关系, 表明AlDREB2 基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达。