两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性。结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达。     

根癌农杆菌介导水稻基因转化研究进展

简要综述了根癌农杆菌介导水稻基因转化的优点及转化后代的遗传学行为 ,着重分析了影响农杆菌介导水稻基因转化的各种因素和存在问题     

根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得

为建立根癌农杆菌介导的草莓褪黑素基因高效遗传转化体系,以草莓品种“早红”叶片和叶柄为外植体,优化了影响根癌农杆菌遗传转化的因素,包括农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和预培养时间等,建立了适宜草莓“早红”的农杆菌遗传转化体系。结果表明,“早红”草莓适宜的转化条件是：外植体的最适预培养时间为2～3 d,农杆菌侵染的最佳菌液浓度为OD600 0.3～0.5,最适侵染时间为15 min,最适共培养时间为3 d。在此基础上,通过根癌农杆菌介导法将褪黑素合成关键酶N -乙酰转移酶（AANAT）和羟吲哚-氧甲基转移酶（HIOMT）基因AANAT和HIOMT转入草莓基因组,并对获得的抗性植株进行PCR和PCR-Southern blot检测分析,结果表明外源基因已经整合进草莓基因组中。RT-PCR分析证明外源基因已经在转录水平表达。     

甘露糖阳性选择系统的建立及在番茄转化中的应用

利用PCR克隆了大肠杆菌(Escherichia coli)6-磷酸甘露糖异构酶基因（pmi)并进行了序列测定。将该基因替换植物表达载体pAMBIA2301中的卡那霉素抗性基因，构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI，并导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。研究了甘露糖对番茄(Lycopersicum esculentum)生长和生根的影响及叶盘对甘露糖的敏感性。通过根癌农杆菌介导对番茄进行遗传转化，获得转化番茄再生植株，并对转化植株进行了PCR扩增检测。研究表明以甘露糖阳性选择系统在番茄遗传转化中应用是可行的。     

大白菜抗软腐病基因BrWRKY33植物表达载体的构建

利用农杆菌侵染法获得抗软腐病转BrWRKY33基因大白菜,首先要构建植物表达载体。本实验根据BrWRKY33基因的序列及pROK2表达载体的酶切位点设计引物(FN/RN),获得BrWRKY33基因,然后将该基因连接到克隆载体pGEM-TEasy,重新构建了克隆载体T-WRKY。经测序及酶切验证,选取PCR反应中错配率最低的产物,构建了表达载体pROK2-WRKY,并将该表达载体转入到根癌农杆菌EHA105中,并对其转化子进行了鉴定。结果表明,PCR扩增获得目的基因BrWRKY33全长约1443bp,PCR及酶切结果鉴定表明克隆载体T-WRKY已经重新构建成功。表达载体的PCR及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定表明有4个重组子表现阳性,表明目的基因已经插入到pROK2表达载体,表达载体构建成功。PCR鉴定表明表达载体pROK2-WRKY已经转入根癌农杆菌EHA105中。本实验结果将为进一步研究大白菜抗软腐病基因的转化奠定基础。     

具双价基因的甘蓝型油菜游离小孢子的遗传转化

以双低(低芥酶和低硫甙)甘蓝型油菜(Brassica napus)游离小孢子为受体，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，将几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因导入杂交油菜新品种油杂4号亲本恢复系和保持系中，成功地获得了转基因植株。在小孢子数与根癌农杆菌数接近时，100-200mg／L羧苄青霉素能有效地抑制菌的生长，而不影响小孢子胚胎形成。用预培养2d的小孢子与根癌农杆菌共培养10h后离心，重新悬浮小孢子于含上述浓度的羧苄青霉素的NLN培养基中培养，获得了16株抗卡那霉素的恢复系的单倍体植株。经PCR及PCR-Southern blot检测，有10株呈阳性，证明外源基因已整合到油菜基因组中。     

链格孢ATMT转化体系的构建及弱毒突变株验证

本文利用来自质粒pUCATPH的构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子(PtrpC)、终止子(TtrpC)和潮霉素磷酸转移酶抗性基因(hph)以及植物表达载体pROKⅡ成功构建了适用于丝状真菌的根癌农杆菌介导转化的双元载体pROKIIHPH,并转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404,建立了根癌农杆菌LBA4404介导的链格孢Alternaria alternata分生孢子转化体系;再从乙酰丁香酮(AS)浓度、不同的共培养时间、受体菌分生孢子浓度和农杆菌菌液浓度对A. alternata转化效率的影响对体系进行优化。结果确定了根癌农杆菌菌液体积为200mL(OD600=0.15),A. alternata分生孢子浓度为106个/mL,在A. tumefaciens的预培养时期以及与A. alternata共培养时期分别加入200μmo1/LAS,共培养时间48h,转化率达120～200个/105分生孢子。在所筛选的约800个转化子中获得了1株毒性明显低于野生菌sd1的弱毒突变株t108,通过PCR验证推测其毒力降低可能由于T-DNA插入阻断了基因的表达。该实验结果为与突变相关基因的研究以及弱毒株t108的进一步研究和利用提供了实验材料,也为深入研究链格孢sd1菌株的基因功能奠定了基础。     

农杆菌介导的木薯转基因研究初报

将米曲霉植酸酶基因phyA克隆于植物表达载体pB1121的CaMV35S启动子（P35s）下游,构建了含有P35s—phyA-TNOS表达盒的重组质粒pBI-phyA,并用电脉冲法将其导人大肠杆菌中。通过三亲接合将pBI—phyA质粒由大肠杆菌导入根癌农杆菌LBA4404菌株,获得带有phvA基因的根癌农杆菌工程菌株LBA4404／pBI-phyA。用LBA4404／pBI—phyA转化木薯外植体652个,在含100mg／L卡那霉素和250mg／L氨苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽,获得24株抗卡那霉素转化苗。以转化苗和未转化植株的总DNA为模板,用phyA基因的同源序列为引物,进行聚合酶链式反应（PCR）,结果表明9株转化苗的PCR结果为阳性,初步证明目的基因phvA已经转入木薯中。     

一种根癌农杆菌介导的GFP亚细胞定位方法的优化

利用根癌农杆菌介导的方法,采用CaMV 35S强启动子启动的含有GFP报告基因的双元表达载体pCAMBIA1301-35S-GFP-AZI1转化烟草表皮细胞。在激光共聚焦显微镜下进行观察,有绿色荧光产生。本文优化了GFP亚细胞定位的方法,即烟草为本氏烟草2～3周龄叶片,菌液OD600值为0.8,共培养时间为32 h,在此条件下能很好地进行GFP的亚细胞定位,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础。     

花青素调节基因Lc对转基因烟草和矮牵牛花色的影响

利用PCR的方法从油菜(Brassica napus)基因组中扩增得到花瓣特异性启动子XY355，将XY355与玉米花青素调节基因Lc融合构建植物表达载体pXY60。用冻融法将pXY60转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后以烟草（Nicotiana tabaccum L.）和矮牵牛（Petunia hybrida）的叶盘为外植体，通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化。对再生植株的PCR检测证明外源基因已经整合到转基因烟草和矮牵牛的基因组中。对转基因烟草和矮牵牛的表型进行观察：转Lc基因烟草的花色由浅红变成了红色，转Lc基因矮牵牛的花色由白色变成了浅紫色。     

农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究

采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。     

根癌农杆菌介导的转录因子DREB1A基因在地被菊花中的遗传转化

以地被菊花（Dendranthema grandiflomm cv．White Snow）无菌苗叶片为外植体，在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养，通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明，2．0mg/L 6-BA和0．2mg/L NAA组合可获得93．8％的再生芽。将含拟南芥（Arabidopsis thaliana）逆境诱导转录因子DREB1A基因的植物表达载体pBI-DREB1A导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，农杆菌介导法遗传转化地被菊花White Snow叶盘，经PCR和PCR—Southem检测，DREB1A基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中，预培养2d后，将OD600=0．5～0．7的根癌农杆菌稀释30倍后侵染叶盘10min，再共培养2d，有利于获得最高遗传转化效率。     

根癌家杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立

用根癌农杆菌菌株LBA4404（pTOK233)转化多种基因型的玉米幼胚。幼胚与农杆菌共培养3d后，检测到了GUS基因的瞬时表达。利用GUS基因的瞬时表达对农杆菌转化玉米的条件进行了优化，共培养后的幼不经含潮霉素的培养基筛选培养两个月后，获得了多种基因型的抗性愈伤组织。其中综3自交系的抗性愈伤组织分化出植株，P9－10、综3自交系R0结实得到后代。Southern杂交分析证实了霉素基因在玉米自交系P9－10基因组中的整合，建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和抗黄萎病转基因植株的获得

为了优化根癌农杆菌介导的棉花下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿抗菌肽基因（alflafa antifungul peptide gene, alfAFP）为目标,利用GUS报告基因和潮霉素抗性基因的检测方法,分析和探讨了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮（AS）的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响。优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404当OD600值为0.5-0.7的菌液浸染5-7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10-15分钟,在含200µmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h可更有效地提高转化率。经上述条件处理的下胚轴在含50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤。愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和southern-PCR分析,发现其中12株含有外源抗病基因alfAFP,可作为棉花抗病育种的种质。     

乙肝表面抗原基因表达载体的构建及对百脉根的转化

利用PCR成功的从乙肝患者血清中扩增出乙肝表面抗原基因,并构建了含有此基因的植物表达载体pBHB。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法将乙肝表面抗原基因转入百脉根(Lotus corniculatus),从转化植株中提取DNA做PCR检测、Southern杂交,阳性结果验证了目的基因已整合到百脉根的基因组中,转化效率为20%,证实转化的载体真实高效。     

瞬时表达黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的dsRNA能阻止相关病毒的侵染

根癌农杆菌介导的瞬时表达法已开始用于研究RNA沉默，在非转基因植物细胞中，如能建立借助于根癌农杆菌介导的瞬时表达法。考察反向重复片段转录出的dsRNA对入侵病毒的干涉作用，则可以快速预测所构建重组载体用于抗病毒基因工程的效果。本研究证明用根癌农杆菌浸润法在植物的叶片组织中瞬时表达dsRNA，可以阻止相关病毒的侵染。     

草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1基因的克隆及其反义表达载体的构建

在已报道的FaEtr1和FaErs1基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓(Fragaria ananassa)乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列和FaErs1基因445bp部分特异序列,将上述2个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1和pBI121Ers1。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA1301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。将这3个重组表达质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1和pFRS导入根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

玉米In5-2启动子功能区域在洋葱瞬时表达系统中的分析

本研究旨在通过对根癌农杆菌侵染洋葱表皮细胞的条件进行优化,从而建立一种新的瞬时表达系统,并将其应用于玉米In5-2启动子的功能区域的分析中,明确In5-2启动子的乙酰苯胺类化合物诱导元件的具体位置.在本研究中采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染洋葱(Allium cepa)表皮细胞,对转β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的瞬时表达进行研究,并分析了侵染液中乙酰丁香酮(As)的浓度、侵染时间、菌液浓度、共培养时间对GUS基因的瞬间表达的影响.结果显示,在OD600值为0.8的农杆菌液中感染15 min,共培养3 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达,从而建立了一种新的瞬间表达系统.同时,构建了含不同长度的玉米(Zea mays)In5-2启动子片段缺失载体,利用新的瞬时表达系统分析其功能区域,推测出乙酰苯胺类化合物诱导元件位于ATG上游-220～-143 bp之间.结果表明新的瞬时表达系统可以快速有效地进行启动子的分析.     

根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化体系的建立

采用携带gus和hpt基因双元表达载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105对向日葵（Helianthus annuus）品种新葵杂6号的茎尖分生组织进行遗传转化,以共培养后7 d外植体的gus基因纯合表达频率为指标测定转化率.结果表明,潮霉素适宜的筛选浓度为10mg/L,根癌农杆菌侵染浓度OD600=0.8,果胶酶（0.05%）与纤维素酶（0.1%）共同消化外植体30 min,共培养温度24℃,共培养培养基中添加乙酰丁香酮（ACS）100μmol/L,向日葵茎尖gus基因纯合表达率高达32.8%.对抗性苗进行PCR和Southern blot检测,初步证明T-DNA上的hpt基因已整合向日葵的基因组中.     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得

为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP.