苜蓿组织培养研究进展

苜蓿Medicago spp.组织培养已在多个种上取得成功,且以紫花苜蓿M. sativa最多。对苜蓿组织培养的外植体选择、培养基组成成分、愈伤组织和体细胞胚的诱导、植株再生以及基因型的选择5个方面阐述了苜蓿组织培养的研究现状。并进一步对目前存在的问题和发展趋势进行了归纳,以期为苜蓿基因工程和细胞工程研究提供有益的借鉴。     

苜蓿植株再生体系研究进展

苜蓿（Medicago sativa）为世界上分布最广的一种牧草,享有“牧草之王”的美誉。本研究结合国内外苜蓿再生体系的研究动态,从再生途径、品种基因型、外植体、基本培养基、生长调节物质及其他添加物的应用6个方面阐述了苜蓿再生体系的研究进展,并对目前存在的问题及未来的发展前景加以探讨,以期为苜蓿再生体系的机理和基因工程方面的研究提供一定的参考。     

紫花与杂花苜蓿再生影响因子的比较研究

对紫花苜蓿(Medicago sativa L.)(秘鲁、关中、甘农3号)及杂花苜蓿(Medicagovaria Martyn)(甘农1号、甘农2号)组培再生体系各影响因子进行比较研究。结果表明:紫花、杂花苜蓿的组培再生能力差异较大,前者显著高于后者;在愈伤组织诱导中,子叶节是最佳的外植体材料;2,4-D浓度增加对紫花苜蓿出愈率影响不明显,但杂花苜蓿的出愈率随着2,4-D浓度的增加呈明显的升高趋势;紫花苜蓿的最佳愈伤组织诱导培养基为MS₊2,4-D2.0mg/L+蔗糖30g/L,诱导率均在95%以上;杂花苜蓿为MS₊2,4-D 4.0mg/L+蔗糖30 g/L,两个品种诱导率分别为65.6%、73.3%;5个品种的最适分化培养基均为MS₊KT 1.0 mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20 g/L或MS₊BA4.0 mg/L,分化率也各有差异,紫花苜蓿不定芽的分化率可达到70%左右,而杂花苜蓿在30%左右;最佳诱导生根的培养基为1/2MS₊IBA 1.0 mg/L;本研究建立了紫花苜蓿高频再生组织培养体系,为实现外源基因的高效遗传转化奠定基础;通过紫花苜蓿和杂花苜蓿的再生体系影响因子的比较研究,为杂花苜蓿再生体系的建立提供参考。     

苜蓿遗传转化的研究进展

综述苜蓿遗传转化研究中,再生体系构建及基因导入方法的研究进展.     

紫花苜蓿不同栽培品种植株再生的研究

离体培养条件下对紫花苜蓿地方栽培品种--陇东苜蓿、和田苜蓿、准格尔苜蓿以及引进品种Rambler苜蓿植株不同部位的再生进行了研究,结果表明,不同的苜蓿品种、外植体、外源激素种类及其浓度等因素均影响着植株的再生.陇东苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率和体细胞胚形成率最高可达91.04%和63.75%;和田苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率最高可达92.05%,体细胞胚形成率最高为56.82%.这2个品种在紫花苜蓿的组织培养植株再生中是较理想的试验材料;紫花苜蓿下胚轴是理想的受体材料.苜蓿愈伤组织的诱导、体细胞胚的形成以2.0 mg/L 2,4-D处理2周为最佳;在2.0 mg/L 2,4-D 0.5～2.0 mg/L 6-BA的作用下,外植体产生愈伤组织以及进一步发育的趋势较强.对体细胞胚的发育和幼苗的形成则以2.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA的激素组合进行处理.适宜的生根培养基为1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.7%琼脂.     

紫花苜蓿组织培养中常遇问题及对策

在总结分析有关植物组织培养技术研究的基础上,结合笔者在紫花苜蓿不同外植体-花药、子叶、下胚轴等培养研究中的体会,对苜蓿组织培养中的一些常遇问题及问题产生的原因和影响因素进行了分析,并提出了相关对策,为苜蓿组织培养技术提供一定的理论基础和实践依据.     

和田苜蓿组织培养中玻璃化现象研究

玻璃化现象是紫花苜蓿组培过程中常见的现象,由于其难以发育成苗或很难移栽成活而严重影响组织培养成功率。以和田苜蓿下胚轴为外植体,以MS为基本培养基,研究了在不同激素配比、蔗糖、琼脂浓度下和田苜蓿再生苗的玻璃化现象,并探索出改善玻璃化现象的措施。研究结果表明:在光照强度为1 000～1 200lx条件下,MS培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA,调整蔗糖浓度20～25g/L、琼脂浓度为7g/L时可有效降低和田苜蓿再生苗玻璃化现象。     

根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的建立与优化

以“中苜1号”紫花苜蓿7日龄无菌苗子叶和再生无菌苗的叶片为材料，建立了适用于农杆菌介导的转基因组织培养体系，并对MsNHX1基因进行转化。转化优化条件为：“中苜1号”紫花苜蓿7日龄无菌苗子叶、再生无菌苗叶片，用农杆菌菌液（A600=0.6）侵染6min，然后在培养基上铺一层灭菌滤纸培养7d后清洗，建立了苜蓿快速有效的遗传转化体系。     

提高不同苜蓿品种体细胞胚发生潜力的研究

在本项研究中，以来自中国东北和内蒙古地区7个商业苜蓿品种为材料，以无菌苗的子叶和叶片作为外植体，对其体细胞胚发生进行了研究。在我们所用的组织培养程序中，所有品种均有体外胚发生，但品种之间形成体细胞胚的能力差别很大。以从子叶和叶片再生植株的叶片为外植体，体细胞胚发生率明显提高，7个品种的平均值分别为73．01％和85．40％。由于体细胞胚诱导效率大大提高，建议在对再生频率低的优良苜蓿品种进行遗传转化时，使用再生植株叶片为外植体。     

2,4-D和6-BA组合配比对金达苜蓿愈伤组织诱导与分化的影响

为了建立一个高效的金达苜蓿(Medicago sativa L. cv. Jinda)组织培养再生体系,我们以金达苜蓿无菌苗的胚轴上段、下段、子叶为外植体,进行了2,4-D和6-BA不同组合配比对愈伤组织诱导和胚性愈伤组织及胚状体分化的影响,这对其以后建立遗传转化体系具有重要的意义。结果表明:胚轴上、下段和子叶是很好的诱导愈伤组织的外植体;在MSO胚状体诱导培养基上,分化出胚性愈伤组织的最佳2,4-D、6-BA剂量配比为8:0.2,成苗培养基为MSO+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。     

牛皮蝇HA抗原基因转化紫花苜蓿的研究

以“甘农1号”紫花苜蓿(Medicago sativa)7 d苗龄子叶和下胚轴为受体材料,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系,筛选出MS+2,4 D 2.0 mg/L+6 BA 0.5 mg/L和MS+6 BA 0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L+GA3 2.0 mg/L为苜蓿子叶愈伤组织诱导和分化的适宜培养基;探讨了农杆菌浓度OD600约0.5、感染时间8~10 min、共培养时间2 d为适宜的转化条件。采用农杆菌介导法将Hyperdomin A（HA）基因导入紫花苜蓿,经PCR检测和Southern分子杂交分析,结果表明HA基因已经整合到苜蓿基因组中,可为牛皮蝇蛆病可食性疫苗的研究提供理论基础。     

种子消毒方法和激素处理对和田大叶紫花苜蓿植株再生的影响

研究了不同种子灭菌方法及次氯酸钠消毒时间对种子萌发率、污染率的影响,并取经灭菌后萌发15～20 d的无菌苗叶片作为外植体,比较了不同激素处理对和田大叶紫花苜蓿愈伤组织诱导及生长的影响.结果表明:(1)流水下冲洗1 h,70%的酒精处理50 s,10%的次氯酸钠震荡22 min是最佳的种子灭菌方法.(2)初步建立和田大叶...     

miR396-MsGRFs参与调控紫花苜蓿愈伤组织再生

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)愈伤组织再生率受基因型限制,是影响苜蓿遗传转化效率的主要因素之一。研究发现,GRF转录因子家族基因在提高多种植物愈伤再生中起着重要促进作用。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGRF序列为模板,在紫花苜蓿基因组序列中查找,获得了含有miR396靶点的9个MsGRFs基因。除MsGRF3a和MsGRF4a外,其余7个MsGRFs在紫花苜蓿胚性愈伤组织中的表达量均显著高于非胚性愈伤。为了进一步研究MsGRFs对紫花苜蓿愈伤再生效率的影响,我们在紫花苜蓿中转入MIM396基因,降低miR396的表达。结果显示：MIM396植株叶片愈伤组织再生时间显著缩短,再生率显著提高;与野生型愈伤组织相比,在MIM396植株叶片诱导的愈伤组织中,除MsGRF3a外,其余MsGRFs显著高表达。以上研究表明,miR396-MsGRF通路对苜蓿愈伤组织再生起着重要调控作用,这为提高苜蓿再生效率,并打破基因型对不同苜蓿品种再生的限制提供候选基因。     

根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化紫花苜蓿的研究

在已建立的紫花苜蓿Medicogo sativa体细胞胚高频再生体系的基础上,研究了OD600、侵染时间、负压处理、预培养及共培养时间、脱菌及选择方法等因子对转化效率的影响,并初步获得了抗性体胚。     

不同苜蓿品种对叶片愈伤组织诱导及植株再生的影响

以7个苜蓿品种叶片为外植体,采用3种诱导培养基、5种分化培养基,共15个组合,研究了不同品种间愈伤组织诱导及植株再生的差异。结果表明,不同苜蓿品种间植株再生率差异显著,超级13R在7个苜蓿品种中表现最佳。     

苜蓿花药悬浮培养体系的建立及其影响因素

苜蓿(Medicago sativa L.)花药悬浮培养体系的建立可为苜蓿体细胞杂交、遗传转化以及获得苜蓿单倍体,建立苜蓿加倍单倍体群体(DH)提供快捷有效的途径。采用固-液培养基结合的方式建立苜蓿花药悬浮培养体系,通过探索体系建立的基础条件及其影响因素,可建立适宜的苜蓿花药悬浮培养体系。结果表明,苜蓿悬浮培养体系中,基本液体培养基为NB培养基,培养液最佳组合为NB+2,4-D 0.3 mg·L^-1+NAA 0.3 mg·L^-1,蔗糖2%;建立苜蓿花药悬浮细胞系,应选取淡黄色或乳白色,结构疏松,颗粒状胚性愈伤组织为悬浮培养的基础材料;苜蓿花药悬浮细胞系继代周期为6~8 d;苜蓿花药悬浮培养时初始接种量为2g/30mL时悬浮细胞PCV、鲜重以及干重的增殖倍数最高,增殖倍数均超过4倍;植物生长调节剂2,4-D的添加浓度以0.3 mg·L^-1为宜;糖作为组织培养过程中唯一的碳源,在苜蓿细胞悬浮培养体系中应有一定的浓度范围。因此,苜蓿花药悬浮培养中,蔗糖浓度为2%-3%时效果最好。     

54Q53紫花苜蓿愈伤组织诱导及再生初探

为建立高效诱导54Q53紫花苜蓿(Medicago sativa)愈伤组织体系,分别研究2种细胞分裂素,3种外植体及4种培养基对愈伤组织诱导的影响,并优化细胞分裂素和生长素的浓度组合.结果表明,采用下胚轴作为外植体在MS基本培养基上添加2.0 mg/L2,4-D+0.5 mg/L 6-BA为最佳诱导愈伤组织方案.另外,...     

紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究

为在不同栽培苜蓿(Medicago sativa)品种上，建立稳定、快速且高效的组织培养体系，本试验以品种'游客’、'Paola’和'Sardi7’为研究材料，探究了苜蓿外植体、激素配比及金属离子(Cu²⁺、Ag⁺)，对其胚性愈伤组织的诱导效果。结果表明：下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体；MS+1 mg·L^-12,4-D+0.2 mg·L^-1 KT为培养基时'游客’和'Paola’胚性愈伤诱导率分别为24.7%，16.7%；MS+2 mg·L^-12,4-D+0.2 mg·L^-1 KT为培养基时'Sardi7’胚性愈伤诱导效果最佳为27.3%；1 μmol·L^-1 和5 μmol·L^-1 Cu²⁺均能显著促进'Sardi7’'游客’和'Paola’愈伤组织的诱导；5 μmol·L^-1 Ag⁺显著诱导'游客’和'Paola’形成胚性愈伤组织，诱导率分别提高25.3%,46.7%(P<0.05)。本研究探索了诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件、金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用，为突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制、提高胚性愈伤组织出愈率提供了思路。     

干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究

为探明干化的体细胞胚作为转基因苜蓿(Medicago sativa)人工种子的可行性,采用农杆菌菌株GV3101 感染苜蓿叶柄的遗传转化方法,获得转化苜蓿植株并诱导转化出苜蓿植株的体细胞胚。将成熟的子叶期体细胞胚先置于含10 mM脱落酸的胚形成培养基BOi2Y中培养14 d,然后将胚置于一系列的6种干燥剂中缓慢干燥7 d,最后将胚转到1/2MSO萌发培养基中,直到茎叶萌发和根形成。分析不同转基因株系干化人工种子的萌发率和再生植株中的GUS表达,并利用Southern杂交分析转基因干化人工种子再生植株的遗传变异。结果表明:干化后的转基因人工种子萌发率达到74.3%,产生的植株从形态上相似于没有干化处理的体细胞胚再生植株。在随机的3个转基因株系中,Southern杂交结果表明再生植株仍能稳定表达GUS,每个株系基因整合位点一致。因此,干化体细胞胚用作转基因植物种质保藏的方法是有效可行的。