转外源法呢基焦磷酸合酶基因烟草抗赤星病研究

将已克隆的薄荷（Mentha spicata L.）法呢基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase, fps）的cDNA插入载体,构建CaMV35S启动子驱动下的植物表达载体pBinARfps。用捕获该质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404与烟草叶片外植体共培养,并在附加30 mg/L Kan的MS＋0.1 mg/L IAA＋1.5 mg/L BA培养基上诱导植株分化,再生芽在附加30 mg/L Kan的MS培养基上生根,再生植株。Kan阳性植株经PCR-Southern检测筛选,得到5株PCR阳性植株（K-4,K-6,K-17,K-19,K-35）,证明外源fps基因在烟草基因组中的整合;Northern blot检测证明外源fps基因在转录水平进行了表达;离体叶片接种实验表明,转基因植株（T₁代）对赤星病抗性明显提高。这表明fps基因在植物抗病基因工程中具有潜在应用价值。     

植物UDP-葡萄糖焦磷酸化酶家族基因鉴定及序列进化分析

UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP glucose pyrophosphorylase, UGP)是糖代谢合成途径中的一个关键酶。UGP以葡萄糖-1-磷酸和尿苷三磷酸为底物,催化反应生成尿苷二磷酸葡萄糖和焦磷酸,直接参与了植物糖代谢的生物合成。为了系统梳理UGP在植物基因组中的状况,我们对其基因进行了全面的鉴定和进化分析,并重点考察该基因在番茄中的表达。首先,我们针对UGP的基因序列,鉴定得到其保守结构域,在此基础上对相关基因进行了全面鉴定,从而构建了其进化树;其次,将番茄CDS序列比对到各探针,从而从数据库中提取组织中的表达数据;最后,通过结构域鉴定,进化树和表达量的分析,得出UGP在植物中的生物合成的机理。本研究为UDP-葡萄糖焦磷酸化酶提供了基因信息,为植物中糖代谢生物合成途径的作用机理及其对蔗糖合成的影响相关基因进化机制的研究提供帮助。     

干旱胁迫下一氧化氮对小麦离体根尖离子吸收的影响

为阐明干旱胁迫下一氧化氮(NO)对植物的保护机制,利用干旱敏感性不同的3个小麦(Triticum aestivum L.)品种的离体根尖,比较了NO对干旱胁迫的响应及其对离子吸收的影响。在干旱胁迫下, 耐旱品种陇春8139根尖中大量产生NO, K⁺和Ca²⁺被大量吸收, 而Cl^-1被排出体外, 质膜H⁺-ATPase活性升高; 而干旱敏感品种甘麦8和定西24的根尖中NO、离子含量和质膜H⁺-ATPase活性的变化呈相反趋势。NO供体硝普纳(SNP)处理使3个品种根尖中的K⁺和Ca²⁺含量增加,Cl^-1含量下降,并能提高质膜H⁺-ATPase活力;NOS抑制剂N^ω-nitro-L-arginine(LNNA)和NO清除剂2-phenyl-4,4,5,5-tetramethyl-imidazoline-1-oxyl- 3-oxide(PTIO)能够逆转这一效果。Na⁺含量在所有处理下都没有明显变化。试验结果证明,NO能够通过调节质膜H⁺-ATPase活力影响植物对离子的选择吸收,从而提高耐旱性。     

小麦蔗糖合成酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的研究进展

植物蔗糖合成酶(SS)和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)在植物淀粉生物合成过程中起着重要的作用,淀粉是小麦等禾谷类作物子粒胚乳的重要组成成分,与作物的产量和品质密切相关。综述了小麦蔗糖合成酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的细胞定位生物学功能、分子生物学分析及酶活性的调控,并进一步对两种酶的研究作出设想。     

拟南芥H~+_-焦磷酸化酶AVP1互作小GTP结合蛋白AtRAB的特性鉴定与功能分析

以拟南芥AVP1为诱饵,采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB。酵母互作试验表明,AVP1和AtRAB存在互作;双分子荧光互补实验(BiFC)证明,AVP1和AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、AtRAB和AVP1的拟南芥突变体rab和avp1在高盐胁迫条件下,随着NaCl浓度的加大,突变体rab和avp1的表型变化相似,相对于WT都表现为根长缩短,侧根数减少;在低磷处理条件下,随着磷浓度的逐渐降低,2个突变体的表型相似,相对于WT同样表现为根长缩短,总根面积减少,侧根数减少;在相同磷浓度条件下,突变体rab对胁迫的反应比avp1强;在低钾处理条件下,随着钾浓度的降低,2个突变体的表型与在低磷胁迫处理条件下的表型相似。结果说明,AVP1和AtRAB可以在细胞膜和细胞核上相互作用,AtRAB能够影响植物对离子的吸收,AVP1和AtRAB的突变体在高盐、低磷和低钾等胁迫条件下表型变化相似,证明了2个基因都正向调控植物对高盐、低磷和低钾胁迫的反应,它们属于同一信号途径。     

叶绿体型转昆虫抗冻蛋白基因烟草的耐寒性

根据已构建的大豆叶绿体表达载体pJY01,设计特异性引物,将昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149插入此载体中构成叶绿体表达载体pJY01-MpAFP149,利用基因枪轰击法转化烟草,经壮观霉素筛选获得4株叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草株系。PCR和PCR-Southern结果显示外源基因已整合至烟草叶绿体基因组中但同质化水平不高,RT-PCR结果也表明昆虫抗冻蛋白基因已发生了转录。将野生型烟草、叶绿体型转抗冻蛋白基因烟草及核转化T₁代转抗冻蛋白基因烟草(pCAMBIA1302- MpAFP149)于–1℃低温处理3 d,观察耐寒表型及测定相对电导率。结果表明, 叶绿体型转基因烟草的耐寒表型优于野生型烟草,但与核转化的T₁代转抗冻蛋白基因烟草无显著差异。处理3 d时,叶绿体型转基因烟草和T₁代转抗冻蛋白基因烟草的电导率分别为39.2%和38.2%,而野生型烟草已达73.7%。本实验获得的异质化转叶绿体抗冻蛋白基因烟草与转核基因烟草的耐寒力无差异。     

转几丁质酶和葡聚糖酶双价基因棉花株系对黄萎病的抗性

 采用人工病圃、重病田及苗期室内鉴定相结合的方法,研究了转双价（Chi+Glu）基因的棉花株系61217-1对棉花黄萎病的抗性。结果表明,转基因棉花株系61217-1在人工病圃连续3年达抗病水平,病指极显著低于其受体中棉所24。2009年该转基因株系在河南安阳、江苏大丰及新疆石河子棉花黄萎病重病田的病指分别为18.7、18.1和16.7,均极显著低于受体中棉所24的病指。该转基因株系对来自河北、湖北、新疆的3个强致病力落叶型菌株均达抗病水平,病指分别为16.4、16.8和15.6,也极显著低于受体中棉所24的病指。表明转双价（Chi+Glu）基因的棉花株系61217-1具有优异稳定的抗黄萎病性。     

小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶同工酶基因型与酶活性及淀粉含量的关系

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定了我国60个代表性小麦品种的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)同工酶基因型, 并测定了AGP活性及总淀粉含量, 以明确小麦籽粒AGP同工酶基因型组成及其与AGP活性和淀粉含量的关系。结果表明, AGP有AGPa、AGPb、AGPc和AGPd 4个等位基因位点, 其出现频率分别为96.7%、80.0%、86.7%和16.7%; 共检测到5种基因型, 其中基因型AGPabc出现频率最高, 为46.7%。不同基因型的品种间AGP活性和总淀粉含量差异显著(P<0.05)。其中具有基因型AGPabcd的品种酶活性及总淀粉含量最高, 表明小麦籽粒中不同AGP同工酶基因型对酶活性及淀粉含量有不同遗传效应。     

利用子房滴注法获得转高亲和性钾离子转运蛋白基因(AlHAK1)棉花植株

棉花植株再生困难、基因型依赖性强和转化周期长等因素一直制约着棉花遗传转化的发展。本研究利用1种不依赖组织培养的转化方法 ,即子房滴注转化方法将獐茅高亲和性钾离子转运蛋白基因(Al HAK1)导入棉花基因组中。结果表明在1006株转化幼苗中有44株为卡那抗性植株,其中35株经PCR检测为阳性(T0代),转化率为3.5%。Southern与Northern杂交结果进一步表明外源基因已整合至棉花基因组中并在转录水平上表达。在提供外源0.05 mmol·L-1 K+水平下,T1转基因棉花叶片中K+含量约为对照植株的2倍,在根中约为野生型植株的1.5倍;而在2.5 mmol·L-1 K+的正常水平下,转基因棉花与野生型植株K+含量差异不明显。在50~200 mmol·L-1 Na Cl胁迫条件下,转基因棉花的种子发芽率明显高于野生型植株,尤其是在150mmol·L-1Na Cl胁迫条件下,转基因植株种子的发芽率是野生型的2.8倍左右。本研究为子房滴注转化体系在生产实践中的广泛应用提供了理论依据,并为培育适应土壤钾素匮乏及盐渍化环境下生长的棉花新品种提供了新的种质资源。     

表面活性剂对转枯草芽孢杆菌纤溶酶基因烟草根系BSFE分泌表达的调节

0.05%~8%(w/v)浓度的常用表面活性剂Triton×100、SDS、DMSO和Tween20可使转枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme,BSFE)基因烟草增加BSFE在根系中的分泌或增加其在水培液中的稳定性,从而促进转BSFE基因烟草水培液BSFE活性的增加。其单位根体积下水培液BSFE活性与培养天数呈抛物线型变化趋势,可模拟为二次回归模型。这种促进作用与表面活性剂的浓度有关。一定浓度的Triton×100、SDS、DMSO和Tween20可作为转BSFE基因烟草根系分泌表达的有效化学调节剂。     

烟草(Nicotiana tabacum)非生物胁迫抗性分子机制研究进展

非生物胁迫影响烟草的生长发育,是制约作物产量和品质的重要因素。本综述阐述了非生物胁迫对烟草的影响以及最新的信号调控机制,包括干旱、盐、低温胁迫。在此基础上,综合分析了某些信号基因可能介导两因素甚至多因素调控过程,以及一些转录因子参与植物对冻害、干旱、盐害等非生物胁迫的应答调控,证明其对植物非生物胁迫的调控往往是多效性的。从分子水平上解析烟草在各种胁迫条件下的适应机制,对烟草种质资源保存、抗逆育种以及提高产量具有重要意义,为进一步研究植物的非生物胁迫应答提供理论依据。     

氮磷钾肥及水分因子对烤烟叶片叶黄素的综合影响

通过盆栽试验探讨了氮、磷、钾肥及水分因子对烤烟叶片叶黄素的综合影响。交互效应测验表明, 影响烤后烟叶叶黄素含量的一级(2因素)和三级(4因素)交互作用显著, 二级(3因素)交互作用中以氮磷水、磷钾水的交互作用为主。一级交互效应分析表明, 氮钾、氮磷、磷钾、磷水、钾水互作对烤后烟叶叶黄素含量的影响表现协同促进作用。氮水间互作中存在一个阈值, 低于这个阈值时氮水间互作对烤后烟叶叶黄素含量的影响表现协同促进作用, 高于这个阈值时表现拮抗作用。二级、三级交互效应分析表明, 氮磷钾合理配施(1∶1.3∶3.1)和适量浇水明显促进叶黄素的积累。当施氮量较少时增施磷肥和适量浇水, 当施磷量较少时增施氮钾肥和适量浇水, 以及当土壤相对含水量较低时增施氮钾肥均可以提高烤烟叶片叶黄素含量。结果表明, 高氮肥(每盆施氮量大于6 g纯氮)、高钾肥(每盆施钾量大于18 g K₂O)、中等磷肥配合适量浇水(74.3%~79.5%的土壤相对含水量)明显促进叶黄素的积累。     

不同有机酸对烤烟品质和产值的影响

采用大田试验研究了苹果酸、油酸和腐殖酸对烤烟品质指标及产值效果的影响。结果表明, 3种有机酸能明显提高烟叶中P素、K素、总糖、还原糖含量、钾氯比和糖碱比值, 以及糠醛、苯甲醛、茄酮、巨豆三烯酮和新植二烯等主要香气成分的含量, 改善烟草的香吃味。同时不同程度地降低烟叶中N素、淀粉、蛋白质、烟碱和氯离子的含量, 从而协调和平衡烟叶中的化学成分, 改善烟叶的品质。其中, 苹果酸的效果最佳, 腐殖酸和油酸次之。苹果酸可明显提高烤烟的均价和上中等烟的比例, 腐殖酸可明显提高烤烟的产量、产值及上中等烟的比例。     

过表达谷子液泡H~+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性

V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对,从谷子中克隆到V-H+-ATPase E亚基基因Si VHA-E。进化树分析显示,Si VHA-E基因在进化上属于E1/E3亚族,与玉米V-H+-ATPase E亚基基因Zm VHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示,Si VHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调,在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明Si VHA-E定位于液泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明,在盐处理条件下,转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比,Si VHA-E过表达植株体内Na+含量减少,体内相对含水量提高。此外,ABA萌发试验结果显示,在种子萌发后期,Si VHA-E过表达植株对ABA更加敏感。研究表明,谷子Si VHA-E可以显著提高拟南芥耐盐性,这可能与其正向调控ABA信号途径以及减少植株体内Na+积累和水分散失有关。     

烤烟不同部位烟叶主要化学成分与叶长的关系

采集我国南方烟区166份烤烟品种K326不同部位叶样品, 研究烤烟主要化学成分与叶片长度的关系。结果表明: 烟碱、总氮、还原糖、钾、氯、氮碱比、糖碱比、钾氯比、叶长在样品间存在广泛的变异; 氯含量和钾氯比在部位间差异不显著, 叶长、烟碱含量、氮碱比和糖碱比在部位间差异显著; 总氮、还原糖含量在中部、下部叶间差异未达到显著水平, 但二者均与上部叶差异显著; 上部、中部叶的钾含量差异不显著, 但二者均与下部叶差异显著; 在一定范围内, 烤烟上部叶烟碱、总氮和钾含量随叶长的增加而增加, 氮碱比随叶长的增加而降低; 中部叶烟碱、还原糖、钾含量和钾氯比随叶长的增加而增加, 氯含量和氮碱比随叶长的增加而降低; 下部叶还原糖含量、糖碱比和钾氯比随叶长的增加而增加, 烟碱、总氮和氯含量随叶长的增加而下降。叶长63.0 cm对上部叶的烟碱、总氮含量和糖碱比与下部叶的钾、氯含量均是一个较为敏感的长度。     

紫花苜蓿Na+/H+ 逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料, 利用反转录PCR方法分离了NHX1全长cDNA(命名为MsNHX1)。Southern杂交结果表明, 在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明, 该基因所编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达MsNHX1-GFP融合基因的结果表明, MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性, 说明MsNHX1具有转运Na⁺的功能。在拟南芥中表达MsNHX1能显著提高植株耐受盐胁迫的能力; 而且在受到盐胁迫时, 转基因植株比野生型的渗透调节能力更强, 生物膜受破坏程度降低, 光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白, 在植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。     

Transfer of cytoplasmic male sterility by spontaneous androgenesis in tobacco (Nicotiana tabacum L.)

Summary Five cytoplasmic male sterile lines of Nicotiana tabacum homozygous for a dominant rootless mutation [Rac^-] were used as female parents in crosses with three male fertile varieties. Androgenetic haploids were selected by their ability to form plantlets with a normal root system, whereas hybrid plantlets failed to grow. High frequencies of androgenetic haploid plants were obtained with N. debneyi cytoplasm, and with one paternal genotype. Chromosome doubling was performed using three different methods (pollination, in vitro culture, acenaphthen) and cytoplasmic male sterile doubled haploid plants have been obtained. The results demonstrate the efficiency of this method for a rapid cytoplasm transfer in Nicotiana tabacum; the integrity of the cytoplasm is conserved. For the first time, we possess a counter selectable marker universally usable for Nicotiana tabacum and closely related species.     

转金属硫蛋白基因(MT1)烟草抗Cd2+胁迫的生理特性分析

将柽柳(Tamarixsp.)金属硫蛋白基因(MT1,GenBank登录号:AB298390)插入植物表达载体pBI121,取代花椰菜病毒35S启动子下游的gus基因,利用农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导法将MT1导入烟草(Nicotiana tobacum)基因组。对具有卡那霉素抗性,且经PCR-Southern检测和Northern杂交表现阳性的转基因株系进行抗Cd2 分析表明,金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因植株的抗Cd2 能力,在含200μmol L-1和400μmol L-1Cd2 的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株MDA含量及POD活性明显低于非转基因株系,叶绿素含量和SOD活性比非转基因株系明显增加。     

田间条件下棉花叶片缺钾症状及钾含量的时空动态研究

为了探究棉花中上部叶片首先出现缺钾症状的生理机制,以中棉所41为供试材料,于2013—2014年在中国农业大学上庄实验站缺钾(K)土壤上(速效K含量64.0~70.9 mg kg–1)进行试验,设置低钾(225 kg K2O hm–2)和高钾(375 kg K2O hm–2)2个钾处理,以不施钾为对照,观察蕾期至花铃后期主茎叶缺K症状的发展动态,并测定了叶片的K+含量。结果表明,棉花叶片缺K症状并不是简单的自下部老叶逐步向上发展,而是从第10节位左右向上推移,并且这种推移呈跳跃式,植株中部某些叶位的叶片一直未出现缺K症状或症状很轻微。棉花这种缺K症状模式与叶片K+含量无必然联系。叶片K+含量基本遵循随叶位上升而增加的规律,符合缺K条件下的一般特征,但这种自下而上增加的幅度及增幅较大的部位在不同生育时期和不同年份存在差异。大部分叶片的K+含量随叶龄增长呈或快或慢的下降趋势,但在蕾期至盛花期某些幼叶和功能叶的K+含量会出现上升现象,如2013年的第7~第14叶、2014年的第13~第16叶。要揭示棉花缺K症状的生理机制,还需要从不同叶片对K+的敏感性、K+在整株水平的再分配等方面深入研究。