Bt杀虫蛋白基因cry8Ea2的克隆、表达和活性

根据已知Bt cry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定.该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白.该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2.经1PTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa的蛋白.表达产物对暗黑鳃金龟.琉璃弧丽金龟和柳蓝叶甲具有活性,在浓度为8.98ug/s时对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟一龄幼虫14 d的校正死亡率分别为46.67%和55.56%;在浓度为89.8 ug/mL时对柳蓝叶甲三龄幼虫96 h的校正死亡率为33.33%.     

含cry8型基因苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定

为发掘对蛴螬有防治作用的苏云金芽孢杆菌及其cry基因,在河北省各县市共采集土壤样品254份,采用温度筛选法分离出Bt菌株42株,经PCR-RFLP方法鉴定,其中10株含有cry8型基因。这些菌株有如下特点：同一菌株含1种或多种质粒;PCR-RFLP鉴定证明有多种cry8基因存在,多数菌株中含2种cry8基因,如cry8E和cry8F常共存于同一菌株中;Cry8杀虫晶体蛋白分子量约为130~140 kDa,晶体形态均为球形。这10株菌采样地点分布于保定、衡水、邯郸、廊坊、唐山和邢台等地,植被类型多样化,说明cry8型Bt菌株在河北省分布广泛,可为蛴螬类害虫的防治提供丰富的Bt资源。     

含cry7类基因的苏云金芽胞杆菌菌株的分析

对我室所保存的18株含cry7类基因的菌株进行晶体形状、生物活性和蛋白型基因型等进行分析.结果表明:这些菌株能产生菱形、小菱形和不规则形伴胞晶体,SDS-PAGE检测主要蛋白的分子量是130 kDa,PCR扩增得到1 300 bp条带.对马铃薯瓢虫二龄幼虫的生物活性测定结果表明,菌株WZ-9具有很高的杀虫率,72 h校正死亡率达到了93.1%;菌株WCG-10活性次之,72 h校正死亡率达到44.8%,而其他菌株杀虫活性低或没有活性.对杀虫活性最高的WZ-9菌株扩增全长基因,得到cry7Ab3基因(GenBank Number:BI 1015188).     

苏云金芽胞杆菌CY1菌株的cry基因分析

通过醋酸钠-抗生素筛选法从河北省土壤中筛选得到了苏云金芽孢杆菌新菌株CY1。镜检可观察到伴孢晶体呈小菱形。SDS-PAGE分析结果表明菌株CY1表达的晶体蛋白分子量为130 kDa。利用25对通用引物检测cry1,cry1I,cry7,cry2,cry3,cry4/cry10,cry5,cry6,cry7,cry8,cry9,cry11,cry13/14,cry16/17,cry18,cry19,cry21,cry22,cry24/25,cry26/28,cry27/29,cry30,cry32,cry34/35,cry40基因,仅从CY1菌株中检测出cry7基因,该cry7基因N末端的1 215 bp片段所编码的氨基酸序列与已发表的Cry7Ab1(Acc No.:U04367)序列同源性达99%,仅有2个氨基酸的差异。用3对cry7Ab特异引物检测,进一步证实该菌株携带有cry7Ab基因。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及 生物信息学分析

不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白。基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害。通过DNA重组技术,从Bt HZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明,cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea的同源性为99.77%~99.91%,对应的氨基酸序列同源性为99.49%~99.74%。对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质。结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关。该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源。     

河北省果园苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定

为了发掘新的Bt资源,从河北省不同果园中(板栗、葡萄、枣、梨)采集土样71份,利用醋酸钠-抗生素筛选法从中筛选出41株Bt菌株.采用通用引物进行PCR扩增鉴定基因型,结果表明,从这些菌株中发现6种不同的基因型cry1、cry7、cry8、cry19、cry26-28、cry32,还有2个菌株未鉴定出基因型.通过SDS-PAGE检测显示,大多数Bt菌株主要蛋白条带分子量约为130 kDa.生物活性测定结果表明,XPZ-6、XPZ-8、XPZ-9、XPZ-39、XPZ-42菌株对小菜蛾、棉铃虫、玉米螟和美国白蛾具有高活性,其中XPZ-39菌株的杀虫活性最高,对4种鳞翅目害虫的杀虫活性均达到97%以上.尽管XPZ-28和XPZ-46菌株的cry基因型未被确定,但是两个菌株分别对柳蓝叶甲和蓼蓝齿胫叶甲有一定的杀虫活性.     

杀虫蛋白基因cry8Fa2的克隆及在Bt无晶体突变株中的表达

以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new.序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133....     

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）cry2Ac4基因;笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,经IPTG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株杀虫晶体蛋白基因分析

苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株是从黑龙江采集的土样中分离获得的新菌株,对其伴孢晶体形状、基因型、蛋白表达以及杀虫活性进行了系统研究.菌株SHJ-5产生的伴孢晶体形状为钝菱形;利用PCR-RFLP技术对该菌株的基因型进行鉴定,结果表明,该菌株含有cry1Aa、cry1Ea、cry1Be、cry1Ah、cry1Ai、cry2...     

苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4杀虫晶体蛋白基因分析

利用稀释平板培养法从连云港地区的土壤中分离了一株苏云金芽孢杆菌新菌株GGD-4,通过PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE方法分析了此菌株中cry基因类型和表达蛋白。结果表明:该菌株中含有cry1Aa基因型,同时表达130~140kD的蛋白;但EcoRⅠ和PstⅠ酶切结果不同于正常的cry1Aa基因,实验中利用生物信息学方法设计的cry1Aa基因特异引物对扩增后也证明含有cry1Aa基因。室内生测结果显示,该菌株对重要的农业害虫甜菜夜蛾、菜青虫等均有较高的杀虫毒力。     

苏云金杆菌Cry8Ea2蛋白的分离纯化及生物活性测定

Cry8Ea2蛋白是一种新型苏云金杆菌杀虫晶体蛋白。通过穿梭载体pSXY422b将cry8Ea2导入Bt无晶体突变菌株中,获得工程菌HD8Ea2。Cry8Ea2蛋白在工程菌中获得表达。通过分子筛层析,成功获得纯化的130 kDa活性毒素蛋白。用改进的生物活性测定方法进行Cry8Ea2蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟一龄幼虫的杀虫活性测定,LC50分别为0.267 9μg/mL和0.071 9μg/mL。研究首次发现Cry8Ea2蛋白对华北大黑鳃金龟具有较高毒力,拓展了该蛋白的杀虫谱,为转基因工程提供了新资源。     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆

此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株（Bacillus thuringiensis）。通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。测序结果表明：该序列与cry1基因同源性达到90%~99%。将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。     

一株含cry新基因的苏云金杆菌菌株的研究

苏云金杆菌XPZ-9菌株是从土壤中分离的对鳞翅目幼虫有特异杀虫活性的新菌株.光学显微镜下观察到该菌株可产生菱形和圆形伴胞晶体,SDS-PAGE 检测表达的主要蛋白条带分子量约为70 kDa.PCR-RFLP分析结果表明该菌株含有新基因cry1Ah.生物活性测定表明该菌株对鳞翅目害虫棉铃虫、小菜蛾、亚洲玉米螟和美国白蛾的...     

杀虫基因Cry1 Ab的合成、表达及其抗虫性鉴定

对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab野生型基因的编码区序列进行改造,以获得密码子优化的抗虫基因,构建原核表达载体后,将重组载体转入大肠杆菌进行诱导表达并对诱导蛋白进行抗虫试验。首先根据植物密码子的偏好性及使用频率,优化、改造并人工合成了Cry1Ab基因,序列分析表明：改造后的Cry1Ab基因全长1848 bp,与原始序列同源性为66%,G+C含量由原来的37.34%提高到63.04%。将改造后的Cry1Ab基因与原核表达载体pET28b(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性菌液进行诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示： Cry1Ab蛋白在BL21(DE3)细胞中得到高效表达,分子量为70 kDa。喂虫试验结果表明：诱导表达的蛋白对玉米螟具有很强的毒性,幼虫死亡率达到93．33%,而且,存活的玉米螟生长发育也受到明显抑制。该抗虫基因可以作为培育转基因抗虫作物的候选基因。     

Quality variations in transgenic rice with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis

In order to estimate the potential of transgenic rice, characteristics related to grain quality and starch viscosity were investigated in six japonica lines based on three primary transgenic lines containing a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis. No significant differences were found between the transgenic lines and the wild type, including negative lines and an untransformed line. All six transgenic lines were comparable in size, milling quality, appearance quality and physicochemical properties to the wild type that were derived from. One exception was that the lines derived from the primary transgenic line TR0‐101 had smaller grains. Crude protein contents were equivalent in all the material tested, but Cry1Ab protein was only detected in grains of transgenic rice and was undetectable in the cooked rice. The viscosity of the starch differed between the transgenic lines, the wild type and other controls, and two transgenic lines had breakdown values (BDV) and setback values (SBV) similar to the wild type. A positional effect of T‐DNA insertion on starch viscosity was found in three primary transgenic lines.