绵羊KAP11.1基因克隆、原核表达及皮肤毛囊表达研究

【目的】 对毛囊角蛋白关联蛋白11.1（keratin associated protein 11.1,KAP11.1）基因进行克隆及原核表达,并对KAP11.1基因在不同品种绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,探究KAP11.1基因在南疆地方绵羊品种间表达差异及其对羊毛品质的影响。【方法】 以平原型和田羊、山区型和田羊和卡拉库尔羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以GenBank中绵羊KAP11.1基因序列（登录号：HQ595347.1）为参照设计引物,对KAP11.1基因进行PCR扩增,构建pMD19-T-KAP11.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测;利用实时荧光定量PCR技术检测KAP11.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况。【结果】 3种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码159个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白。相似性比对结果发现,与参照基因相比,2种类型和田羊基因序列相似性均为99.79％,均在423 bp处发生突变,由C变为T,卡拉库尔羊基因序列相似性为99.38％,其69 bp处G变为T、93 bp处C变为T、423 bp处C变为T。系统进化树分析发现,3种绵羊和山羊亲缘关系最近,和瘤牛亲缘关系最远。KAP11.1蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成。试验成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并纯化得到19 ku的KAP11.1蛋白。KAP11.1基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊皮肤毛囊中的表达量均显著高于平原型和田羊（P<0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊中差异不显著（P>0.05）。【结论】 克隆获得480 bp的绵羊KAP11.1基因CDS区序列,成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并获得19 ku的KAP11.1蛋白,且KAP11.1基因在3个品种绵羊皮肤毛囊中均有表达。     

平原型和田羊毛囊KAP4.2基因的克隆与原核表达

为了探索影响平原型和田羊羊毛品质的角蛋白关联蛋白(keratin association protein,KAP)4.2基因的结构与功能,试验以平原型和田羊毛囊总RNA反转录得到的cDNA为模板,经RT-PCR扩增KAP4.2基因成熟蛋白序列,与pMD18-T载体连接,经PCR扩增、双酶切鉴定连接正确后再与原核表达载体pET-28a连接,连接正确后对其测序并进行同源性分析及氨基酸分析。结果表明:平原型和田羊重组质粒pMD-18T-KAP4.2构建成功,表达质粒pET-28a-KAP4.2成功原核表达。在不同诱导时间KAP4.2基因表达蛋白的量明显不同,在诱导4小时时蛋白表达量最大;不同体积IPTG诱导后KAP4.2基因表达蛋白的量明显不同,体积为10μL时蛋白表达量最大。平原型和田羊毛囊KAP4.2基因序列与GenBank中美利奴羊(X05639.1)基因序列同源性为99.1%,显示有3处发生突变,分别为第77位的T突变为C,第108位的G突变为T,第200位的C突变为T。平原型和田羊KAP4.2蛋白基因第26位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸,第67位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。说明平原型和田羊毛囊KAP4.2基因序列与GenBank中美利奴羊基因序列同源性较高,虽然高度保守,但存在碱基突变和氨基的变异。     

山区型和田羊毛囊KIF2.9基因的克隆与生物信息学分析

为了探究毛囊KIF2.9基因对半粗毛型地方品种绵羊羊毛品质和性状的影响,试验以山区型和田羊为试验动物,提取毛囊总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增毛囊KIF2.9基因,并定向插入pMD18-T克隆载体中构建pMD18-T-KIF2.9克隆质粒,经双酶切、PCR鉴定及测序分析正确后,将山区型和田羊毛囊KIF2.9基因连接到原核表达载体pET-28a(+)中,构建毛囊KIF2.9基因的pET28a(+)-KIF2.9原核表达重组质粒,检测其正确性,并运用DNAMAN、ProtParam、ExPASy、MEGA 5.0等软件对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明:山区型和田羊毛囊KIF2.9基因编码序列大小为1 527 bp,编码509个氨基酸。与GenBank中美利奴羊比较,毛囊KIF2.9碱基序列有20处碱基发生突变,但仅造成第292位丙氨酸→缬氨酸,第414位谷氨酰胺→谷氨酸,第466位色氨酸→苏氨酸这3处氨基酸的变异。与美利奴羊毛囊KIF2.9基因的序列比对,其碱基同源性为98.69%,但氨基酸序列同源性高达99.41%。与美利奴羊毛囊KIF2.9基因蛋白结构比对,蛋白质一级结构中原子总数、分子质量、脂肪酸系数略高于美利奴,氨基酸数目、等电点、平均疏水性等无明显差异;蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链所占比例没有明显差异;蛋白质三级结构中某些肽段结构发生了变化。KIF2.9基因分子系统进化树反映山区型和田羊与美利奴羊亲缘关系较近。说明山区型和田羊与美利奴羊的羊毛类型有差异,但毛囊KIF2.9基因在氨基酸水平上高度相似,亲缘关系较近。     

山区型和田羊毛囊HGT蛋白KAP6.1、KAP7与KAP8的基因克隆分析

探索山区型和田羊毛囊高甘氨酸/酪氨酸(High Glycine/Tyrosine,HGT)蛋白家族KAP6.1、KAP7与KAP8基因的结构与功能。提取山区型和田羊皮肤毛囊总RNA,获得毛囊HGT蛋白中KAP6.1、KAP7与KAP8基因成熟蛋白编码序列,构建重组质粒并进行了原核表达。结果显示:山区型和田羊毛囊KAP6.1、KAP7与KAP8的基因序列与Gen Bank中3个基因序列高度同源,经SDS-PAGE检测到相应蛋白的特异性表达条带。成功在原核细胞中表达了山区型和田羊毛囊HGT蛋白3个家族的主要基因。这些基因是羊毛的结构基因,对于改善地毯毛用粗毛羊的羊毛品质、提高其产毛量具有重要意义。     

舍饲和田羊与卡拉库尔羊生长发育指标的测定

本研究旨在对新疆南部地方品种绵羊平原型和田羊、山区型和田羊及卡拉库尔羊的17种生长发育指标进行检测分析,了解农区舍饲条件下新疆南部地方品种绵羊的基本生长发育情况。主要进行了2个品种、品系绵羊断奶后7个多月期间的17项生长指标的检测,通过SPSS 17.0统计软件分析其各项指标的差异显著性。结果表明：6月龄时,平原型和田羊与山区型和田羊间体高、尻长存在差异显著性(P<0.05),而后胸宽、尾长、尾宽、尾厚的差异极显著(P<0.01);山区型和田羊与卡拉库尔羊间前胸宽、后胸宽存在差异显著性(P<0.05);平原型和田羊与卡拉库尔羊间体重、胸围存在差异显著性(P<0.05),且前胸宽、后胸宽、尾长、尾宽、尾厚的差异极显著(P<0.01)。所检测各项指标的平均月增长量,平原型和田羊与山区型和田羊间体高存在差异显著性(P<0.05),而山区型和田羊与卡拉库尔羊间体高差异极显著(P<0.01);山区型和田羊与卡拉库尔羊管围存在差异显著性（P<0.05）;平原型和田羊与卡拉库尔羊间尾厚存在差异显著性(P<0.05)。对于绵羊体重、体长、体高、胸围等生长发育规律的研究结果表明,平原型和田羊的生长发育与山区型和田羊以及卡拉库尔羊相比较在这些方面具有优势。     

不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1基因差异表达研究

试验旨在研究不同品种绵羊皮肤毛囊中角蛋白关联蛋白8-1（keratin associated protein 8-1,KAP8-1）基因相对表达量,从而明确KAP8-1基因对绵羊皮肤毛囊发育的调控作用。采用Real-time PCR SYBR GreenⅠ染料法,测定KAP8-1基因荧光定量Ct值,所得结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。结果表明,南非肉用美利奴羊（♂）×东北细毛羊（♀）组、南非肉用美利奴羊（♂）×小尾寒羊（♀）组、杜泊羊（♂）×小尾寒羊（♀）组3个品种羊皮肤毛囊内KAP8-1基因均有表达,且三者相对表达量的比值为7.56∶2.19∶1。说明KAP8-1基因对皮肤毛囊发育、羊毛品质差异均具有一定的调控作用,且品种之间存在一定的差异。     

和田羊Myostatin蛋白成熟肽的基因克隆及原核表达

为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM₀01009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。     

绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

新疆卡拉库尔羊感染绵羊慢病毒的血清学调查

绵羊慢病毒（OvLV）感染已证实存在于新疆绵羊群体中的几个主要绵羊品种，即半粗毛（地毯毛）边区莱斯特（Border Leicester）羊及其与和田羊的杂种，细毛羊新疆美利奴羊（中国美利奴新疆型）和裘皮羊新疆卡拉库尔羊（新疆羔皮羊）。经病毒学和病理学研究证实，病原为1型绵羊慢病毒，边区莱斯特羊为对OvLV的敏感品种，新疆美利奴羊是对OvLV的低敏感性品种。为了探讨新疆卡拉库尔羊对OvLV的品种敏感性，作者等对新疆（南疆）阿克苏地区的新疆卡拉库尔羊的OvLV感染进行了血清学调查，本文报道两次调查的结果，并对本病的控制、影响血清学阳性率的因素和新疆卡拉库尔羊对OvLV的品种敏感性进行讨论。     

新疆4种绵羊羊毛氨基酸含量测定

为了研究遗传及环境对羊毛生产性状的影响,利用高效液相色谱法测定了新疆地区和田羊、卡拉库尔羊、多浪羊、中国美利奴羊4个绵羊品种羊毛中的17种氨基酸含量,探索不同品种绵羊间和同一品种不同品系绵羊间羊毛氨基酸含量的差异。结果表明,和田羊羊毛的氨基酸总含量显著高于多浪羊羊毛,差异显著(P＜0.05);其他品种间氨基酸总量差异不显著。多浪羊羊毛中的Asp、Ser、Glu、Arg、Thr、Ala、Pro、Val、Lys、Ile、Leu、Phe等氨基酸含量均低于其他品种;卡拉库尔羊羊毛只有Cys含量高于其他品种,Ser、Gly、Thr、Pro、Tyr等氨基酸含量均低于其他品种。各品种羊毛的螺旋比值(促螺旋氨基酸含量/阻螺旋氨基酸含量),中国美利奴为0.90,卡拉库尔羊为0.79,和田羊为0.77,多浪羊为0.75。结果表明,和田羊氨基酸总含量高于其他品种,中国美利奴螺旋比值高于其他品种,卡拉库尔羊Cys含量高于其他品种。     

HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸－酪氨酸蛋白（HGTP）启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著（P<0.01）,HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关（P<0.01）,与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关（P<0.05）,而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关（P<0.01）。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著（P<0.01）。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性（P<0.01）。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

新疆细毛羊pEGFP-C2-KAP6.1真核表达质粒的构建与鉴定

试验采集新疆细毛羊皮肤组织,提取RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出KAP6.1基因,并通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-C2真核表达载体上,构建pEGFP-C2-KAP6.1重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定。结果表明,本试验成功构建了新疆细毛羊的pEGFP-C2-KAP6.1真核表达重组质粒,为进一步研究该基因所编码的蛋白与毛品质的关系,以及培育超细羊毛等经济性生物学性状相互关系提供理论依据。     

绵羊角蛋白关联蛋白2基因的克隆表达与生物信息学分析

本研究旨在克隆新吉细毛羊和小尾寒羊的角蛋白关联蛋白2（keratin-associated protein 2,KAP2）基因并对其进行生物信息学分析,并初步探讨KAP2基因与羊毛毛用性状分子的关系。分别提取新吉细毛羊和小尾寒羊皮肤组织中总RNA,用RT-PCR方法扩增KAP2基因,将PCR产物克隆于pMD19-T载体,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-KAP2并进行PCR扩增、双酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果表明,试验成功克隆了大小为463 bp的KAP2基因,开放阅读框架（ORF）长414 bp,编码137个氨基酸。测序结果比对发现,与小尾寒羊KAP2基因相比,新吉细毛羊的KAP2基因中存在1个由G→A的碱基突变,编码氨基酸由精氨酸（Arg）变为谷氨酰胺（Gln）,属于错义突变。新吉细毛羊和小尾寒羊的KAP2蛋白的分子质量分别为14.81和14.84 ku,等电点分别是9.67与9.82,两种绵羊KAP蛋白的基本理化性质无明显差异,同属于碱性疏水性、跨膜蛋白;预测到蛋白二级结构均由α螺旋、延伸链、无规则卷曲等构成,新吉细毛羊和小尾寒羊KAP2蛋白三级结构中存在一个由α螺旋引起的空间结构的差异位点。综合以上结果推测KAP2基因可能是影响羊毛性状的差异基因,本试验结果可为探讨两种绵羊毛用性状表型差异的分子遗传奠定理论基础。     

SHH在美利奴羊与小尾寒羊背部皮肤表达差异的研究

为了研究音猬因子(sonic hedgehog, SHH)在不同品种绵羊背部皮肤中的表达差异,以探索SHH与羊毛弯曲形成的关系,选取美利奴羊和小尾寒羊作为研究对象,利用HE染色法观察2种绵羊背部皮肤的组织结构,采用免疫组织化学技术、实时荧光定量PCR和Western blot方法探究2种绵羊背部皮肤中SHH蛋白和基因水平的相对表达量差异。结果显示:HE染色显示美利奴羊与小尾寒羊背部皮肤毛囊的组织结构存在毛囊数量及弯曲程度等差异;免疫组织化学试验显示,SHH蛋白在美利奴羊和小尾寒羊背部皮肤中均有表达,在美利奴羊背部皮肤中的毛乳头、毛基质、内外根鞘、皮脂腺和表皮细胞中显著表达,在小尾寒羊背部皮肤中的毛基质、内外根鞘和皮脂腺中显著表达;光密度分析显示,美利奴羊背部皮肤组织中SHH蛋白的表达量显著高于小尾寒羊(P<0.001);实时荧光定量PCR显示,美利奴羊SHH mRNA相对表达水平显著高于小尾寒羊(P<0.01);Western blot显示,美利奴羊SHH蛋白相对表达水平显著高于小尾寒羊(P<0.01)。提示:羊毛弯曲的形成与其组织结构有关,并受SHH的调控。     

绵羊角蛋白关联蛋白8.2基因克隆与表达分析

本研究旨在克隆绵羊角蛋白关联蛋白8.2(keratin-associated protein,KAP8.2)基因mRNA并分析该基因在不同组织器官的表达分布。首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KAP8.2基因并进行两个品种间的比较分析,实时荧光定量PCR方法分析两个品种间KAP8.2基因的表达谱差异。结果表明已成功克隆出绵羊KAP8.2基因mRNA,该片段长574 bp,其中ORF区192 bp,编码63个氨基酸,甘氨酸(Gly)和酪氨酸(Tyr)含量依次为23.8%和20.6%,属于典型的HGT-KAP家族。多态性分析显示新吉细毛羊与小尾寒羊KAP8.2基因间存在丰富的多态性,多态位点多位于CDS区两侧,其中小尾寒羊KAP8.2基因3'UTR区c192+19-39出现一个疑似fru-let-7j的作用靶位。不同组织表达谱分析显示该基因为多组织表达基因,但两个品种羊不同组织表达谱存在较大差异,表现为小尾寒羊在脾脏、肝脏和皮肤中高表达,而新吉细毛羊则在皮肤和心脏中高表达。本研究提示小尾寒羊与新吉细毛羊KAP8.2基因在基因多态性还是组织表达分布上存在显著差异,提示该基因与毛表型性状相关。