牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测

经生物学软件DNAStar分析,以牛传染性鼻气管炎病毒(Banha Nu/67)基因组DNA为模板,PCR扩增gD基因943bp的片段,将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到部分可溶表达的重组蛋白。用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.852mg/mL,纯度为85.2%。Westem blot、间接ELISA检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因截短表达及其抗血清制备

gD糖蛋白是IBRV感染细胞的主要分子,在病毒吸附和侵入宿主细胞中发挥着重要作用。利用IBRV基因组DNA为模板,经生物学软件DNAstar分析主要抗原区,PCR扩增gD基因786bp片段,定向连接到pET32a(+)表达载体中,筛选阳性克隆转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达部分可溶的重组蛋白。Ni-NTA非变性纯化系统纯化蛋白,纯化的蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,利用间接ELISA法检测抗血清效价为1∶6400;同时以该血清进行血清中和病毒实验,中和指数为1∶640,显示该抗血清具有良好的抗病毒能力,为进一步开发牛传染性鼻气管炎(IBR)的诊断检测试剂和疫苗奠定了重要基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的克隆与表达

构建pET32a重组表达载体,转化到BL21(DE3),诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRV的gD基因序列设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增一条766bp的目的基因gD,将gD基因克隆到原核表达载体pet32a,得到重组表达载体pet32-gD,转化到BL21(DE)中,通过IPTG诱导获得融合蛋白。重组表达蛋白经纯化后,免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行分析与鉴定。用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白作为免疫原免疫8周龄的Balb/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀后,收集腹水,纯化后进行单克隆抗体浓度、纯度、类及亚类、抗体效价、相对亲和常数、Western blot和间接免疫荧光测定。结果表明,筛选到2株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4和9D7A7。4G3D4和9D7A7这2株单抗纯化后的浓度分别为2.6 mg/mL、1.6 mg/mL;亲和常数分别为2.30E+10、1.88E+09;抗体亚类均为IgG1,轻链为kappa链;且均能与IBRV发生特异性反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;间接ELISA测定腹水效价分别为1∶204800、1∶12800。利用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白成功制备了2株单克隆抗体,为下一步建立特异性的IBRV检测方法奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒抗体胶体金检测试纸条的制备

采用SF 9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原,经纯化鉴定后将gD蛋白用胶体金标记作为示踪抗原,未标记的gD抗原作为捕获抗原,并以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体,建立了牛传染性鼻气管炎病毒双抗原夹心法胶体金检测试纸条。试验结果表明,该试纸条检测灵敏度高,特异性良好,与牛口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒等阳性血清无交叉反应。使用建立的胶体金试纸条和IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒抗体ELISA检测试剂盒同时检测112份牛血清,阳性符合率为93.5%,阴性符合率为96.0%,总符合率为94.6%。说明该试纸条可以应用于临床牛传染性鼻气管炎病毒抗体的诊断和检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒部分糖蛋白的研究进展

牛传染性鼻气管炎又名牛疱疹病毒Ⅰ型感染症,是一种急性、热性、接触性传染病,该病能给养牛业造成重大经济损失.该病毒是双股DNA有囊膜的病毒,病毒囊膜糖蛋白对病毒的吸附、侵入和细胞间扩散是必需的,可刺激机体产生中和抗体.囊膜糖蛋白的研究不仅能了解病毒分子生物学的结构和功能,而且对该病的诊断和预防也具有重要意义.笔者就gB蛋白和gE蛋白的结构和分子生物学特性作一综述,并对其进行了展望.     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因表达质粒免疫小鼠的试验研究

基因疫苗是近几年来发展起来的一种新型疫苗，具有使用安全，生产、运输、贮存方便，免疫效果稳定持久的特点。实验采用PCR方法将从洛阳种牛场西门塔尔牛精液中分离的牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhino—traeheitis virus，IBRV)洛精株gD基因进行了扩增，经序列测定确证后构建了gD基因的真核表达质粒。将其单独或连同脂质体肌肉注射于BALB／c小鼠，应用ELISA定期检测血清抗体水平。结果表明，含IBRV gD基因的表达质粒能够引起小鼠的特异性血清抗体反应。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白主要抗原区域的高效表达、纯化与鉴定

参照IBRV基因组序列,设计合成1对特异性引物,扩增了长约846 bp的gD基因片段。将目的片段定向克隆到pET-30a原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。本研究利用原核表达系统成功表达具有良好抗原性的gD蛋白,为IBRV的深入研究及诊断试剂的研制奠定了物质基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸的研制

将gD蛋白用胶体金标记并包被于结合垫作为检测探针,未标记的gD蛋白包被NC膜作为检测线,以金标记鼠IgG与羊抗鼠IgG作为独立质控系统,利用双抗原夹心法建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)抗体的胶体金免疫层析试纸,并对该试纸进行了性能评价。结果显示,该试纸在检测副结核分枝杆菌(MAP)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛支原体(M.bovis)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、口蹄疫病毒(FMDV)的标准阳性血清时均为阴性反应;该试纸在检测IBRV标准阳性血清时敏感性为1∶16;将该试纸与进口商品化ELISA试剂盒共同检测60份待检牛血清,两者的阳性符合率为93.3%,阴性符合率为100%,总符合率为96.7%。结果表明,本试验建立的胶体金免疫层析试纸可在10～15 min完成检测,具有快速、准确、简便等特点,为临床定性检测及现场诊断牛传染性鼻气管炎提供了有效工具。     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成GH-1、GH-2两条引物,分别以IBRV的Barta Nu/67株、IBRVBK125株基因组DNA为模板进行扩增,结果两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对其同属的伪狂犬病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒（HVT）及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）进行扩增均未见特异性条带;敏感性检测表明,该法对IBR病毒的检出限量为104.25TCID50/0.1mL.     

Expression and Biological Activity of Single Chain Antibody Against gD Glycoprotein of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus in Insect Cells

For preparation of bioactive single chain fragment variable (ScFv) which was targeted against envelope glycoprotein D (gD) of infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV),VH and VL genes were amplified from the cDNA of lymphocyte hybridoma, then VH and VL genes were integrated with a Linker by SOE-PCR,and the ScFv gene was cloned into the baculovirus vector pFB-LIC-Bse, which was transformed into Escherichia coli DH10Bac competent cells to construct a recombinant bacmid rBacmid-VH-VL. Finally,ScFv was expressed by transfected rBacmid-VH-VL into insect Sf9 cells, its molecular weight was about 30 ku. The result of Western blotting suggested that ScFv generated in Sf9 cells was specifically binds to His antibody,the protein also showed high affinity to gD of IBRV. The result of indirect immunofluorescence assay showed that ScFv could recognize IBRV which infected bovine kidney cells (MDBK). The study indicated that the recombinant ScFv was expressed in Sf9 cells, and could bind to gD of IBRV specifically. The result could provide the basis for the diagnosis and treatment of infection of IBRV.     

牛传染性鼻气管炎病毒截短gB基因原核表达与间接ELISA诊断方法建立

用DNAstar-Protean分析牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白的亲水性、抗原性和表面展示概率,据IBRVgB全基因序列设计引物,PCR扩增编码385-550位氨基酸的基因序列。将目的片段克隆,酶切鉴定并测序鉴定后,定向连接到pET-28b载体上,转化表达菌DE3并诱导表达。经SDS-PAGE分析,获得大小约为21.4 ku的目的蛋白,与预测值相符。纯化后的蛋白浓度约为2.0 mg/mL,纯度为95.27%。间接ELISA及Western blotting证明,表达的目的蛋白具有抗原性。以该蛋白作为诊断抗原建立的间接ELISA诊断方法,确定的抗原包被量为50μg/mL,血清的最佳稀释倍数为50。与进口IBRV全毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性为92.3%、敏感性为93.8%、符合率为93.3%;试验结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性。     

牛传染性鼻气管炎活疫苗安全性和免疫保护效果研究

本试验使用牛传染性鼻气管炎弱毒活疫苗进行安全性和免疫保护效果研究,将该疫苗分别接种1月龄犊牛、6~8月龄牛及后备母牛,接种剂量为2 mL(10头份),检验疫苗安全性。将疫苗接种6~8月龄牛,接种剂量为1 mL(1头份),疫苗接种后28 d使用检验用强毒进行攻毒,检验疫苗对攻击用强毒的保护效力。结果表明,不同月龄牛接种疫苗后体温正常,无任何临床可见异常,后备母牛接种疫苗后精神状态及食欲均良好,无流产、死胎及木乃伊胎出现。疫苗接种牛对强毒攻击可产生较好的抵抗力,攻毒保护率达5/5。 研究结果表明,该疫苗对牛安全,且免疫保护效果良好。     

奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10^-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。     

牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

经DNAstar分析，据牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）全基因序列设计合成gB基因的特异性引物，以构建的pGM-T-gB为模板，PCR扩增IBRVgB蛋白192-266位氨基酸的基因序列。将目的片段克隆，酶切鉴定并测序鉴定后，定向插入pET32a表达载体中，转化表达菌BL21。SDS-PAGE电泳分析表明，诱导表达产物以包涵体和可溶形式存在，大小约为29．2ku，与预测值相符。亲和纯化后重组蛋白浓度为2．000mg／mL，纯度为79．2％。间接ELISA检测证明，表达蛋白具有抗原性。以该蛋白作为诊断抗原，建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为50／zg／mL，血清的最佳稀释度为1：40，阳性标准定为s／e〉0．395。交叉试验表明对牛流热（BEV）、牛肺疫（CBPP）、牛病毒性腹泻（BVD）、牛结核（BTB）、牛副结核（PBB）以及牛赤羽病（BAD）等其它6种疾病阳性血清不发生交叉反应。与中和试验相比较，特异性、敏感性和符合率分别为83．3％、90．9％和88．9％；与进口法国IBRV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较，特异性、敏感性和符合率分别为92％、92．7％和92．5％。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性，显示了良好的应用前景。     

牛传染性鼻气管炎弱毒与牛病毒性腹泻弱毒抗原免疫干扰的研究

本试验使用3~6月龄健康易感牛9头(牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体均阴性),共分3组,每组3头犊牛。第1组首免肌肉注射IBRV-LNM弱毒疫苗株种毒,接种1周后,每头牛接种BVDV-SM弱毒疫苗株;第2组只接种BVDV-SM弱毒疫苗株种毒,接种时间同第1组;第3组为对照组,接种MDBK细胞培养液。接种BVDV-SM疫苗毒后每周采血至疫苗毒接种后28 d,测定接种后BVDV抗体效价,并采用BVDV-JL检验用强毒进行攻毒试验。结果表明,第1组与第2组试验动物血清中牛病毒性腹泻病毒抗体水平无明显差异,能够抵抗BVDV-JL强毒攻击达到免疫保护的效果,说明牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-LNM弱毒疫苗株接种后在牛体内对牛病毒性腹泻病毒BVDV-SM疫苗毒不产生免疫干扰作用。     

牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ｇＢ基因序列,应用ｏｌｉｇｏ４．１程序设计一对引物ＰＢ１／ＰＢ２,分别对ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲ病毒ＤＮＡ均有３９９ｂｐ的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染必喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增。均未见特异性条带,证