Preparation and Identification of Monoclonal Antibody Against Swainsonine

In this test,BALB/c mice were immunized by SW-OVA for the preparation of monoclonal antibody against swainsonine (SW). Hybridoma cells that could secrete specific antibody against SW were prepared by hybridoma technique,and then the strain that secreted monoclonal antibody against SW designated 1F10 was prepared,and the chromosome average number of 1F10 cell was 45 to 50 couples. The ELISA titers of cell supernatant were 1:25 600, and that of ascites were 1:80 000.The subclasses of monoclonal antibody was IgG1,and the affinity constant was 1.14×10¹⁰,the purity of ascites antibodies was up to 98%,and the recovery rate was 80%.The result of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis proved that purified antibody had been obtained that the molecular weight of H-chain and L-chain of antibody was about 50 and 25 ku. The monoclonal antibody against SW specifically bound to SW determined by Western blotting. The linear range was 4 to 128 μg/mL (R²=0.9969) and no cross-reactivity was detected with BSA,gelatin,polylysine,me-Gal,etc. The result laid the foundation for immunodetection on SW and immunological prevention of animal toxic disease.     

变异黄芪中苦马豆素的分离与鉴定

目的：研究变异黄芪的生物碱成分。方法：变异黄芪经甲醇热回流提取，回收甲醇至浸膏。浸膏用1mol／l盐酸研溶至生物碱沉淀反应为阴性，过滤，所得滤液氯仿萃取除去色素等杂质，然后用氢氧化钠碱化调pH为9～11，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。采用薄层层析技术分析各部分生物碱成分。正丁醇部分经硅胶柱层析进行分离，纯化。所得化合物通过熔点和波谱技术(IR、MS、^1HNMR、^13CNMR)鉴定其化学结构。结果：从正丁醇部分分离、纯化得到一种白色针状晶体25．3mg，结构鉴定为苦马豆素。计算变异黄芪中苦马豆素的提取率为0．0013%。     

苦马豆素抗肿瘤作用研究进展

苦马豆素(SW)是一种吲哚里西啶生物碱,最早是从灰苦马豆中分离得到,是疯草类植物的主要毒性成分.它能抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长与转移.此外,SW能促进脾细胞增殖,增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,还能促进机体淋巴细胞活性升高,刺激机体骨髓细胞增殖,增强机体杀灭肿瘤细胞的能力.由于SW具有很好的抗肿瘤活性和免疫增强作用,已引起国内外学者的广泛关注,并作为抗肿瘤药物筛选的后备药物.目前,国外SW抗肿瘤药物的研发已进入Ⅲ期临床试验阶段,而国内才刚起步.论文主要介绍了SW抗肿瘤作用及其临床治疗效果,并对SW下一步研究重点及应用前景进行了展望.     

变异黄芪毒性成分苦马豆素的分离与鉴定

采用植物化学成分系统研究的方法,从变异黄芪醇提总浸膏中分段萃取得到石油醚提取部分、氯仿提取部分、乙酸乙酯提取部分和正丁醇提取部分.正丁醇提取部分经聚酰胺柱和硅胶柱色谱分离、薄层层析检测和升华技术分离纯化出一种白色针状结晶,通过熔点测定和IR、MS、1HNMR、13CNMR波谱分析鉴定为苦马豆素.通过与同类植物的比较分析,证明苦马豆素就是变异黄芪的主要有毒成分.     

苦马豆素生物合成研究进展

苦马豆素(SW)是苦马豆属、棘豆属、黄芪属、番薯属和黄花稔属等某些有毒植物的主要毒性成分,动物采食该类植物后,会发生以神经系统功能紊乱为特征的中毒病。研究表明,豆类丝核菌、金龟子绿僵菌和疯草内生真菌均可以产生苦马豆素。植物和真菌中苦马豆素的生物合成研究可为人类从根本上解决含有SW有毒植物引起的动物中毒问题和促进SW的医学研究及应用提供重要的科学依据。论文根据近年来的最新研究,重点围绕植物和真菌中苦马豆素的生物合成及其相关研究进行综述,以期为该类研究的开展提供思路。     

苦马豆素的来源及分离方法进展

苦马豆素(SW)是疯草的主要毒性成分,研究表明它具有明显的抗肿瘤活性。目前,SW作为一种崭新的抗癌药物倍受关注其实验室分离技术已取得很大进展,并已通过索氏抽提、柱层析、离子交换层析、高效液相色谱、萃取等方法分别从苦马豆属、棘豆属、黄芪属的多种植物及豆类丝核菌中分离出了SW。文章对SW来源和的分离进行了综述。     

苦马豆素的性质,分离与检测

苦马豆素的发现引起了植物学，病理学、病理学、化学、生物化学、免疫学和医学界的极大兴趣，从而促进了苦马豆素及其相关化合物的研究。本文着重介绍苦马豆素的理化性质，化学名称、来源、提取分离与检测。     

苦马豆素的毒性,代谢与用途

综述了吲哚兹定生物碱－苦巴豆素的中毒剂量，毒性作用机理，代谢动力学及抗肿瘤作用实验研究，临床前毒性研究，临床应用研究与其他潜在用途。     

苦马豆素研究进展

1　苦马豆素研究简史苦马豆素 (swainsonine)因最初分离于灰苦马豆 (Swain-sona canesces)而得名〔1〕。其发现历经一个世纪。自从 Marsh(190 5～ 190 7)〔2〕证实疯草病与采食某些棘豆属和黄芪属植物有关以后 ,许多学者进行了毒素的分离研究。 Cauch(192 9)〔3〕从兰伯氏棘豆中分离出一种疯草毒素 ,可以引起猫的疯草病 ,他描述这种毒素是一种稳定的带有多羟基的含氮化合物 ,易溶于水 ,不溶于氯仿、乙醚和烃类溶剂 ,但由于当时条件所限未能进行结构鉴定。Frap(1936 )〔4〕从密柔毛黄芪中分离出一种毒性成分 ,呈碱性 ,吸水性强 ,取名为洛克…     

马绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

本研究采用马绒毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin,eCG)纯品免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1∶10融合,间接酶联免疫吸附法(ELISA)筛选阳性克隆和有限稀释法克隆,扩大培养后于小鼠腹腔制备腹水,共得到8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用间接ELISA测定抗体效价,效价均达10^-5以上。用获得的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体,为eCG分泌水平的ELISA检测方法的建立确立了条件。     

氟罗沙星单克隆抗体的制备及鉴定

采用碳二亚胺(EDC)法将氟罗沙星(FLE)与载体蛋白BSA、OVA分别偶联合成人工抗原BSA-FLE、OVA-FLE,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外分析法对合成的人工抗原进行了鉴定。BSA-FLE用作免疫抗原免疫Balb/C小鼠,OVA-FLE用作检测抗原包被酶标板检测抗体效价。免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合获得了5株(4F11、2C3、8G2、3C1、2G8)稳定分泌抗FLE抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型鉴定均为IgG1。将3C1接种小鼠制备腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化,纯化后腹水效价1∶1 024 000。抗体分子量160.766 KD,亲和常数为8.57×108M-1。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及鉴定

将纯化的犬瘟热病毒(CDV)分别与弗氏完全佐荆(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)乳化制备的乳化抗原作为免疫原,以有限稀释法和间接ELISA法进行单克隆抗体的筛选,从而获得了3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7、3G2、5E3.亚型鉴定结果显示,2F7为IgG2a型,3G2为IgGl,5E3为IgGM.用2F7制...     

克伦特罗单克隆抗体的研制及初步鉴定

为制备克伦特罗(clenbuterol,CL)单克隆抗体,鉴定其特性,采用重氮化法合成克伦特罗-人血清白蛋白(CL-HSA)作为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术建立杂交瘤细胞株,利用体内诱生法制备单克隆抗体,用间接ELISA和间接竞争ELISA分别测定抗体效价和特异性.将细胞反复冻存和传代,考察稳定性.获得细胞株C611...     

拉沙里菌素单克隆抗体的研制及间接竞争ELISA检测方法的建立

为制备拉沙里菌素（LAS）单克隆抗体,建立针对LAS的间接竞争ELISA（Ci-ELISA）方法,试验采用了活性酯法将LAS分别与BSA和OVA偶联成LAS-BSA和LAS-OVA作为免疫原和检测原,6次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,最终筛选出一株能稳定分泌抗LAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株C11。经鉴定,C11的抗体类型为IgG1,轻链为κ链;所制腹水效价为1∶16 000,与莫能菌素钠、盐霉素钠、马杜霉素胺、头孢噻吩钠和硫酸链霉素均无交叉反应。用此单克隆抗体建立LAS Ci-ELISA检测方法显示,Ci-ELISA标准工作曲线为y=0.376x－0.2374（R²=0.9914）,LAS在5~1 000 ng/mL时,线性关系良好,IC₅₀为90.22 ng/mL,加标回收率为81.76%~102.41%,表明方法精确度好、灵敏度高。LAS单克隆抗体的制备和Ci-ELISA方法的建立为下一步试剂盒的研发奠定了基础。     

Preparation of Monoclonal Antibody Against Lasalocid and Deveopment of Indirect Competitive ELISA Detection Method

To prepare monoclonal antibodies (MAb) against lasalocid (LAS) and establish an indirect competitive ELISA (Ci-ELISA) detection method,conjuaction of LAS-BSA and LAS-OVA were synthetized as the immunogen and coating antigen by using active ester method in this experiment. After 6 times of immunization,the spleen cells of mice and myeloma cells were fused. Finally,a hybridoma cell line that could stably secrete specific MAb against LAS was screened.The immunological subtype of the MAb was identified as IgG1,and its light chain was κ type.The titer of the ascites was 1:16 000, which showed no cross activity with monensin sodium, salinomycin sodium,maduramycin,cefalotin sodium and streptomycin sulfate. Ci-ELISA method was established based on the MAb against LAS with the linear equation was y=0.376x-0.2374(R²=0.9914), and the linear range was 5 to 1 000 ng/mL and the IC₅₀ was 90.22 ng/mL. The method was used to detect LAS in spiked samples and the recovery rate was 81.76% to 102.41% within the detection range,indicating that the method was successfully established with good accuracy and high sensitivity. The preparation of MAb against LAS and the establishment of Ci-ELISA method laid the foundation for the development of LAS detection kit.     

苯乙醇胺A单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

为制备苯乙醇胺A(phenylethanolamine A,PA)单克隆抗体,建立一种针对苯乙醇胺A的快速、简便、灵敏度高的检测方法,本试验采用重氮化法将制备的苯乙醇胺A衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联作为免疫原和包被原。利用弗氏佐剂充分乳化免疫原(PA-BSA),按常规免疫程序免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,选择血清抗体效价较高的小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以PEG法进行细胞融合。结果显示,经3次细胞亚克隆筛选后,最终筛选出一株可稳定分泌抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为D6H8,利用此细胞以小鼠体内诱生法制备抗体。经鉴定,D6H8腹水抗体亚型为IgG1,轻链为κ链;纯化后的抗体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、盐酸异丙肾上腺素和盐酸去氧肾上腺素均无明显的交叉反应(CR<0.18%),表明该抗体特异性良好。利用此抗体建立针对苯乙醇胺A药物残留检测的间接竞争ELISA方法,结果表明,腹水抗体效价为1∶12 800,猪肉中苯乙醇胺A添加浓度在5～1 000 ng/mL时线性关系良好,标准工作曲线为y=0.3861x-0.1845 (R^2=0.990),其IC₅₀为58.88 ng/mL,LOD为3.83 ng/mL,回收率在85.96%～104.32%之间。综上所述,本试验成功建立了检测苯乙醇胺A药物残留的间接竞争ELISA方法,该方法灵敏度高、稳定性较好。     

阪崎肠杆菌单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

试验旨在制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体,初步建立其ELISA检测方法。以灭活的阪崎肠杆菌全菌体为抗原免疫BALB/c小鼠,筛选血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备杂交瘤细胞,并用间接ELISA法选取阳性杂交瘤细胞,扩大培养后测定单克隆抗体的效价,进行特异性及抗体间的配对,使用mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,并利用得到的抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法。本试验得到3株具有良好特异性能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株5C10、2B6和Ab02,经两两配对,据阳性D_{450 nm}值及P/N值选择1：20000稀释的5C10作为包被抗体,1：40000稀释的Ab02作为酶标二抗,建立ELISA检测法,应用建立的方法与荧光定量PCR方法检测动物实验室保存的20份进出口送检奶粉样品,结果显示试验结果一致。本试验成功制备阪崎肠杆菌的单克隆抗体并建立其ELISA检测法,为大批量快速检测阪崎杆菌奠定了基础。     

新城疫病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV） M蛋白单克隆抗体,本研究将编码该蛋白的基因克隆、表达并纯化重组蛋白,作为免疫原免疫小鼠,同时建立ELISA筛选方法对小鼠血清效价进行测定,筛选出血清抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,最终获得能稳定产生NDV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行了抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定、杂交瘤细胞染色体计数、小鼠腹水制备及腹水内单克隆抗体效价测定。结果显示,PCR、重组质粒测序及双酶切鉴定正确,M基因大小约为1 095 bp。SDS-PAGE和Western blotting检测显示,试验成功表达了重组M蛋白,分子质量约为60 ku,且可与NDV阳性血清反应。建立的ELISA筛选方法中,重组M蛋白、His标签蛋白和抗体的最佳工作浓度分别为0.5 μg/mL、0.5 μg/mL和1∶256 000。抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定显示,杂交瘤细胞产生的抗体可与NDV SG10株及重组M蛋白特异性结合,其轻链为κ,重链为IgG2A。C9-G2、D3-F2杂交瘤细胞染色体计数结果分别为97和101条;杂交瘤细胞上清的ELISA检测效价均为1∶6 400,腹水的ELISA检测效价分别为1∶409 600和1∶102 400。本研究成功制备了NDV M蛋白的单克隆抗体,可为进一步研究M蛋白的功能提供工具。