鸭1型甲肝病毒亚型的鉴定

为了明确引起雏鸭胰腺炎的新型鸭1型甲肝病毒(duck hepatitis A virus 1,DHAV-1)的分类地位,通过鸭胚血清交叉中和试验测定并分析其与经典的肝炎型DHAV-1的抗原相关性。经血清交叉中和试验测得抗胰腺炎型DHAV-1阳性血清对胰腺炎型DHAV-1、经典的肝炎型DHAV-1的中和效价分别为1∶169.8、1∶91.2,而抗肝炎型DHAV-1阳性血清对经典的肝炎型DHAV-1、胰腺炎型DHAV-1的中和效价分别为1∶125.9、1∶89.1。参照同属小RNA病毒科的口蹄疫病毒血清型、亚型的划分标准,计算得出胰腺炎型DHAV-1与经典的肝炎型DHAV-1间的抗原亲源值(R)为0.62,介于0.32~0.7之间,表明胰腺炎型DHAV-1与经典的肝炎型DHAV-1相比其抗原性发生了较大变异,定名为鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)。     

鸭甲肝病毒1型和3型HRM检测方法的建立

本研究根据鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的5′UTR基因的保守区域,设计了1对特异性的引物,扩增目的片段大小约为199 bp.通过优化反应条件,建立了基于高分辨率熔解曲线(HRM)分析的鸭甲肝病毒1型和鸭甲肝病毒3型的鉴别检测方法.特异性试验结果表明,该方法能特异性地检测出DHAV-1和DHAV-...     

基因C型鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,并掌握该致病原的遗传进化特征,进行了临床病料的RT-PCR检测、病毒分离与鸭胚病变特征观察、分离毒株半数致死量(ELD50)测定、动物回归试验、VP1基因序列分析等研究。结果显示:临床病料样品经DHAV-C特异性引物检测为阳性,病料样品可引起10日龄鸭胚规律性死亡以及肝脏肿大、出血等特征性病变,分离毒株对鸭胚的ELD50为10^-6.32/0.1mL,分离毒株对雏鸭的致死率达100%,并可引起雏鸭精神沉郁、运动障碍、肝脏肿大出血等典型症状,分离毒株VP1基因序列与GenBank中登录的DHAV-C VP1基因的同源性在96.5%~100%之间,遗传进化关系中分离毒株与DHAV-C各毒株处于同一个分支,而与DHAV-A、DHAV-B处于不同分支。试验结果为研制针对DHAV-C流行毒株的诊断试剂和新型疫苗奠定了基础。     

鸭甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析

通过PCR技术,从自行分离的鸭甲肝病毒JS株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段,并对该片段进行序列测定及分析。结果显示JS-VP1与DHAV-A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%~64.4%之间,与DHAV-B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%~63.8%之间,与DHAV-C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%~98.5%之间,分析表明JS株为鸭甲肝病毒基因C型,血清型分型为韩国新型。进化树表明JS株与SD02株的亲缘关系较进,进一步说明VP1基因的核苷酸序列是DHAV基因组中的高度可变区,可作为DHAV基因型研究的标记,分离毒株为DHAV的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达

为原核表达基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白,本研究通过设计套式PCR引物,RT-PCR扩增DHAV-C VP1全基因,约为720 bp,将其亚克隆至pET-32a(+)载体中构建重组表达质粒pET-VP1。将其转化E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达了约47 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与兔抗DHAV-C阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

检测鸭1型甲肝病毒抗体间接ELISA方法的建立

为了建立快速检测鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)抗体的血清学方法,本试验利用纯化浓缩的鸭1型甲肝病毒亚型MPZJ1206株病毒作为包被抗原,建立了检测DHAV-1a血清抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化。结果表明,该方法简单、快速、特异性强、重复性好、稳定性高,可用于鸭群DHAV-1a感染的血清学监测及其抗体消长规律的检测。     

表达Ⅰ型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒的构建

扩增鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因,并在其中间引入Bgl II酶切位点,再之克隆到pUC19载体,获得载体pTK。用限制性内切酶从已有质粒pcDNA-LacZ上切下CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒,插入到pTK的TK基因中,获得质粒pTCL。用质粒T-VP1做模板,扩增出I型鸭甲肝病毒(以前称为血清I型鸭肝炎病毒)VP1基因,克隆到质粒pTCL表达盒的多克隆位点KpnI与XbaI之间,构建含LacZ及VP1基因的转移载体质粒pT-CL-VP1。将此转移载体与鸭瘟病毒C-KCE毒株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达I型鸭甲肝病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒。     

1型鸭甲肝病毒LY0801株VP1基因在鸭胚传代中的变异规律研究

为了解1型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus type 1）VP1基因在鸭胚传代中的变异规律,本研究将LY0801株DHAV-1在鸭胚体内传代至30代,分别对1~5、10、15、20、25、30代病毒进行VP1基因的克隆测序。各代次病毒分别以108copies/胚接种9日龄健康鸭胚,测定各组鸭胚的平均死亡时间和病毒在鸭胚尿囊液中的增殖拷贝数。结果表明：DHAV-1在鸭胚传代过程中,不同代次之间出现12个氨基酸的反复变异和同步变异,分别为R43M（K）、T48A、T101S、L169F、T180I、S181L、R183Q、E184A（K）、G187D、D193N、M213R、H219Y;在传代过程中,病毒致死鸭胚的时间逐渐延迟,但病毒在鸭胚内的增殖拷贝数未呈现稳定增长的趋势。     

一例雏番鸭感染鸭1型甲肝病毒的诊断

2016年3月,广东茂名某鸭场雏番鸭出现大量死亡,死亡雏番鸭多呈运动失调、角弓反张症状。解剖死亡雏鸭可见肝脏点状出血、肾脏肿大出血。初步诊断疑似鸭病毒性肝炎。采集病死鸭肝脏、脾脏等组织,分别进行细菌分离鉴定及病毒RT-PCR检测。结果显示,送检样品能扩增出约321 bp大小的鸭甲型肝炎病毒特异性引物条带,细菌分离为阴性。结合临床剖检症状和实验室检测结果,确诊该群雏番鸭发病的病原为鸭1型甲肝病毒。     

一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道

自山东省某疑似鸭肝炎发病鸭肝脏中分离到两株病毒,命名为TA1和TA2,分离毒分别回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。利用鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）特异性引物进行RT-PCR 扩增,结果为阳性,经测序证实为DHAV-1和DHAV-3。分别扩增分离毒的VP1基因,经序列测定及遗传进化关系分析发现,分离毒TA1和DHAV-3毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-3遗传距离最近,属于基因C型;分离毒TA2和DHAV-1毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-1的遗传距离最近,属基因A型。     

Development and Identification of Monoclonal Antibodies against VP1 Protein of DHAV-1a

To prepare the monoclonal antibodies (MAbs) against DHAV-1a, hybridomas were produced by fusing SP2/0 cells with spleen cells from mouse immunized with DHAV-1a pGEX-VP1 recombinant protein. Two hybridomas stablely secreting MAbs against VP1 protein were identified by indirect ELISA detection with DHAV-1a as coating antigen. The ascetic fluids of MAbs were 1:3.2×10⁴ and 1:2.0×10⁶, respectively. The MAbs were IgG1 with κ chain. Western blotting analysis showed that the MAbs could recognize the recombinant VP1 protein and DHAV-1a. The neutralization tests showed that one MAb (5G3) had better neutralization activity. Therefore, the results showed that the ELISA titers and specialities of two MAbs were very good, with excellent stability. In addition, they all had cross interaction with DHAV-1 and DHAV-1a, one of which had good neutralization activity.     

麋鹿重组朊蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

为研制鹿慢性消耗性疾病(chronic wasting disease,CWD)单克隆抗体,本研究以原核表达后经纯化的麋鹿重组成熟朊蛋白(PrP^c)为免疫原免疫PrP^c基因敲除小鼠(PrP^c-null mice)。两次加强免疫后,利用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,采用3次有限稀释法实现杂交瘤细胞的亚克隆,筛选出5株能稳定分泌针对麋鹿重组成熟朊蛋白特异性单克隆杭体(McAbs)的杂交瘤细胞株5A5、3B2、6D12、5E3、1F5,其腹水ELISA效价均达到1∶10000以上。经鉴定,5株单抗均为IgG抗体,5A5、6D12、5E3株为IgG1亚类,3B2、1F5株为IgG2a亚类。Western blotting鉴定结果表明,获得的McAbs均能特异性识别麋鹿重组成熟朊蛋白和健康麋鹿脑组织匀浆中的PrP^c。本研究制备了CWD腹水McAbs,同时也为CWD的研究及其诊断方法的建立奠定了基础。     

抗鸡传染性法氏囊病病毒VP3单克隆抗体制备及抗原表位的初步分析

用纯化的原核表达的IBDV VP3蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次有限稀释,获得分泌抗IBDV VP3抗体的4株(HRB-7B、HAR-7C、HRB-3F、HRB-10E)杂交瘤细胞系。结果表明,4株杂交瘤细胞分泌的抗体均能够特异地与IBDV VP3蛋白反应,细胞上清ELISA效价均在5.0×102以上,腹水ELISA效价为6.4×106以上;相加ELISA及肽扫描结果表明,4株中仅HRB-7C和HRB-10E 2株单抗针对的抗原表位相近,并利用肽扫描的方法初步定位4株单克隆抗体的抗原表位。本研究对进一步分析IBDV的结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义。     

禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定

旨在制备禽致病性大肠杆菌（APEC）染色体编码外膜蛋白（cOmpT）的特异性单克隆抗体,本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT,经IPTG诱导表达后,获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT,利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT,并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法,最适抗原包被浓度为0.625 μg·mL^-1,最适血清稀释度为1：6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合,采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体,分别命名为1G8、2C3和2G3,均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1：200、1：3 200和1：3 200。Western blot结果显示,3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应,而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达,对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定,结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是⁸³DQDWMDS⁸⁹、⁹⁰SNPGTW⁹⁵和¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³。本研究成功制备了3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体,并对其识别的抗原表位进行了鉴定,为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。     

Development of Monoclonal Antibodies against the cOmpT Protein of Avian Pathogenic Escherichia coli and Identification of Epitopes Recognized by Monoclonal Antibodies

To development monoclonal antibodies against cOmpT of avian pathogenic Escherichia coli (APEC), the recombinant cOmpT of APEC origin expression plasmid pET-28a-compT was employed, and cOmpT protein with a molecular weight about 36 kD in the form of inclusion bodies was obtained after induction with IPTG, and then renatured by urea gradient dialysis. BALB/c mice were immunized with the purified cOmpT. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA) was developed, the optimal coating concentration of the antigen was 0.625 μg·mL^-1 and the optimal serum dilution was 1:6 400. After the fourth immunization, the spleen of immunized mice was collected for cell fusion, three monoclonal hybridomas that can secrete antibody specific to cOmpT were obtained after multiple screenings, named 1G8, 2C3 and 2G3 respectively. And all of their immunoglobulin subclasses were IgG2b. The titers of monoclonal antibodies in the cell culture supernatant were 1:200, 1:3 200 and 1:3 200 determined by iELISA, respectively. All three monoclonal antibodies were confirmed to react with cOmpT in Western blot, without cross reaction with other tested bacteria. The antigenic epitopes recognized by the three monoclonal antibodies were identified by using a series of E. coli strains harboring expression plasmids recombined with truncated fragments from compT gene. The results revealed that the antigenic epitope required for reactivity with the 1G8 was ⁸³DQDWMDS⁸⁹, and ⁹⁰SNPGTW⁹⁵, ¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³were recognized by 2C3 and 2G3, respectively. In this study, three monoclonal antibodies against cOmpT were successfully developed and the antigenic epitopes recognized by the antibodies were identified. The cOmpT specific monoclonal antibodies obtained in this study are potentially useful tools for both the functional study of cOmpT and the development of APEC epitope vaccines.     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定

拟制备针对鸡传染性贫血病毒(CIAV) VP2蛋白的单克隆抗体(mAb),为CIAV的诊断和病毒生物学特性研究提供有用制剂.以PCR技术扩增CIAV VP2基因并克隆到原核表达载体pET-32a中,经IPTG诱导表达.以原核表达的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术研制并筛选分泌抗CIAV VP2蛋白mAb的阳...     

抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

自2016年以来,鹅星状病毒(GoAstV)已成为当前危害鹅养殖业生产的重要病原体之一,雏鹅均易感,主要引起9～19日龄雏鹅死亡,以雏鹅腿关节肿胀及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎为主要病征.建立相应的病原学与血清学检测方法对于防控该病至关重要.为建立基于病毒Cap蛋白的诊断技术,本研究构建了鹅星状病毒去核定位信号肽的Cap基因...     

抗犬瘟热病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗犬瘟热病毒(CDV)血凝素蛋白的单克隆抗体,以CDV弱毒株Onderstepoort免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合制备杂交瘤细胞。用昆虫杆状病毒表达系统表达的血凝素蛋白作为ELISA包被抗原,进行杂交瘤细胞筛选,获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名3A8、3E4和1C7。经鉴定,抗体均为IgG1亚型,轻链为kappa链。杂交瘤细胞培养上清中抗体效价为1∶64~1∶256,腹水中抗体效价为1∶10~5~1∶10~7,病毒中和试验表明,3E4对CDV具有中和活性,腹水中抗体中和效价为1∶512。制备的单克隆抗体为CDV感染动物的治疗和基因工程抗体的开发奠定了基础。     

恩诺沙星单克隆抗体的制备及其鉴定

采用碳二亚胺法和氯甲酸异丁酯法合成恩诺沙星的人工抗原,结合比为15∶1。用人工抗原腹腔免疫BALB/c小鼠,有限稀释法筛选获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株2H10C2F11,并将该细胞株注射小鼠腹腔获得腹水。纯化后的抗体效价为3.96×10-6,紫外分析方法计算蛋白含量为1.139 mg/mL,琼脂双扩实验表明抗体为IgG1型,SDS-PAGE电泳图谱显示纯化效果理想;经间接ELISA方法测定,抗体的亲和力为1.8×108L/moL。     

犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。