H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

牛病毒性腹泻二温式PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5’端非编码区设计了1对可以扩增244bp BVDV某段基因序列的特异性引物,优化建立了BVD的二温式PCR快速检测方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;最低能检测到1pg牛病毒性腹泻病毒RNA。本研究所建立的BVD二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。     

口蹄疫病毒RT-PCR检测与血清型鉴别

针对编码非结构蛋白的3D基因合成一对引物进行口蹄疫病毒RT-PCR扩增,不同血清型病毒的RNA样本均显现一条457bp的目的带,与预期设计的长度相符合。在敏感性试验中,O型、A型和AsiaⅠ型病毒的最小RNA检出量分别为0.8ng、8ng和8ng。根据GenBank发表的口蹄疫病毒VP1和2A基因序列,采用多重RT-PCR鉴别口蹄疫病毒血清型,O型、A型和AsiaⅠ型病毒的特异性扩增片段分别为200bp、340bp和500bp。对9份乳鼠感染病料进行检测,确诊为O血清型口蹄疫病毒感染。     

口蹄疫与经典猪瘟二联RT-PCR诊断方法的建立及其应用

根据口蹄疫病毒(FMDV)与猪瘟病毒(CSFV)基因组序列高度保守区,设计合成2对引物,以CSFV和FMDV培养物提取RNA并反转录,进行RT-PCR特异性片段扩增,扩增片段大小分别为200 bp、141 bp.结果表明,扩增产物与设计的2对引物之间的序列大小一致.通过特异性与敏感性试验,CSFV与FMDV培养物均可扩增至10-5倍稀释,最终建立的二联RT-PCR方法对上述2种病毒的敏感性亦可达10-4倍稀释,约10 pg的总RNA,证明本法对上述2种病毒具有快速、特异和高度敏感的特点.     

H5、H9亚型禽流感病毒快速鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断我国目前流行的禽流感，根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计并合成2对特异性引物，利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT—PCR扩增，并对二联RT—PCR检测方法进行了敏感性及特异性试验。结果表明，这2对引物能特异地扩增H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段，大小分别为490bp和686bp；该检测方法敏感性高，特异性强；初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立快速、准确检测H3亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据GenBank中H3亚型AIV HA基因序列,设计出1对特异性引物,通过优化反应条件建立了H3亚型AIV二温式RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性检测,并对256份临床样品进行检测。结果表明,该法只能扩增H3亚型AIV,对其他亚型AIV及常见禽病病原体不扩增;对H3亚型AIV检测下限为1×10~4拷贝/μL;256份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。与普通RT-PCR相比该法节省了30min,表明所建立的H3亚型AIV二温式RT-PCR方法是一种快速、简便和特异的检测方法。     

鸡细小病毒二温式PCR检测方法的建立

根据鸡细小病毒(chicken parvovirus,ChPV)的保守基因NS1设计了1对特异性引物,建立并优化了能够快速检测ChPV的二温式PCR方法。结果表明:该二温式PCR只对ChPV敏感,扩增产物为302 bp的特异性条带,其最低能检测到38.6 fg的ChPV DNA;而对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒不敏感。对60份临床样品进行检测,检出率为20%(12/60)。说明所建立的ChPV二温式PCR方法是一种快速简便、特异性强、敏感性高的检测方法,适用于ChPV的临床检测。     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒（CaPV）末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法。结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性。与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性。表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测。     

口蹄疫病毒RT-PCR检测和分型方法的建立及初步应用

参考GenBank中各个血清型口蹄疫病毒3D、vp1、2A基因的标准序列，设计引物P1／P2和S1／S2。建立用于检测口蹄疫病毒及其利用引物S1／S2克隆片段同源性比较而确定血清型的RT-PCR方法。通过敏感性试验检测，2对引物均可以检测到10TCID50的病毒量；特异性试验的检测，2对引物对正常细胞、牛黏膜病病毒、猪瘟病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。利用该方法对病牛的流涎液体、水疱液体、舌皮组织、感染犊牛心脏等组织进行检测初步结果显示：该方法可以对O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒进行特异性检测，能够用于口蹄疫急性及亚临床感染的诊断及流行病学调查。     

应用套式PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的试验

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的S基因核苷酸序列，设计合成了2对引物，以猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒细胞培养物为模板，进行PCR特异性片段扩增，猪传染性胃肠炎病毒扩增片段大小为886bp，猪呼吸道冠状病毒扩增片段大小为214bp。建立的套式PCR经过特异性、敏感性试验及对临床送检样品检测，证明本法具有快速、特异和高度敏感的特点。     

Development and Application of Two-temperature RT-PCR for Detectionof Type O Foot and Mouth Disease Virus

According to the gene sequences analysis of foot and mouth disease virus (FMDV) in GenBank,a pair of specific primers was designed in the conserved sequence of type O FMDV P1 gene. The reaction parameters were optimized using the uniform design method to develop a two-temperature RT-PCR method for detection of type O FMDV.The results of sensitivity and specificity showed that the two-temperature RT-PCR method was only specific for type O FMDV without amplification of the other viruses. The amplified fragment was same with the expected length.The cloning and sequencing results revealed that the sequence of amplified fragment had 100% simililarity to the target sequence,and the minimum detection quantity was 1.665 pg/μL,the effective detection rate was consistent with the three step RT-PCR sensitivity test results. 54 taper toxicity test pigs were detected,and positive identification results and three-step PCR results was consistent.Compared with the three-step PCR,it could save 20 min.These results indicated that the developed two-temperature RT-PCR for detection of type O FMDV was a kind of accurate,rapid,specific and sensitive detection method.     

Detection of Foot and Mouth Disease Virus by RT-PCR and Microplate Hydridization Assay Using Inactivated Viral Antigens

A single step RT-PCR was tested for detection of foot and mouth disease virus (FMDV) and immunoenzymatic determination of amplified products in a microplate hybridization assay. Inactivated reference strains (ELISA antigen) of all seven serotypes were used to optimize the test. Oligonucleotide primers were selected from two different genomic regions coding for RNA polymerase and VP1 protein, respectively. The RT-PCR used to amplify the polymerase gene specific RNA detected FMDV strains A, C, O, Asial and SAT1, and the identity of the fragments obtained was confirmed with a specific internal biotin-labelled capture probe. For the amplification of the VP1 genome region, two sets of oligonucleotide primers were used. One primer pair was successfully applied for the detection of serotypes A, C, O and Asial and a second one for serotypes SAT1, SAT2, SAT3. The specific probe enabled the detection of all the amplified products in a PCR ELISA test. By comparison with antigen ELISA, the PCR ELISA method allowed the detection of smaller amounts of FMDV in the inactivated material examined. The application of molecular diagnostic methods to inactivated antigens offers a good alternative procedure for developing and optimizing a sensitive method for detection of FMDV in laboratories that are not allowed to work with viable FMDV.     

3株O型FMDV VP1基因的克隆与序列分析

以3株国内分离的O型口蹄疫病毒(FMDV)(分别命名F1、F2、F3)为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计2对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的cD-NA片段,将3个cDNA片段分别克隆到pMD20-T Vector载体中进行序列测定,得到3个毒株VP1基因的序列。结果表明,3个O型FMDV毒株VP1基因cDNA长度均为639 bp,编码213个氨基酸。3株O型毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在92.3%~94.2%之间,推导氨基酸序列同源性在97.2%~98.6%之间。与3个毒株同源性高的主要为香港和台湾的毒株。     

O型口蹄疫病毒3D基因荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立快速检测抗FMDV转基因猪中O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的荧光定量PCR方法,本试验选择FMDV结构蛋白基因 3D的核苷酸序列设计特异性引物,经过RNA抽提、反转录成cDNA、PCR扩增,扩增出了大小为180 bp的基因片段.将回收的目的片段与pMD18-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞.提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为FMDV的阳性重组质粒.将验证正确的重组质粒10倍梯度稀释后作模板,进行荧光定量PCR试验,建立FMDV 3D基因的标准曲线及其回归方程,并确定扩增的最佳退火温度.试验结果显示标准曲线的回归方程为Y=-3.727X+32.04,回归系数R²=0.980,熔解曲线为单一峰.建立的荧光定量PCR方法的灵敏度为1.2×10¹ 拷贝/μL,只与FMDV反应.结果表明,建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,为检测FMDV在动物组织细胞中的含量提供了技术方法.     

检测奶牛隐性感染FMDV RT-PCR方法的建立及应用

根据已发表的口蹄疫病毒(FMDV)基因序列设计了一对引物,扩增FMDV 3D后1/3区段,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从组织培养液中扩增出大小为489 bp的基因片段,建立了FMDV RT-PCR检测方法.该方法灵敏度高,可检测出0.01个TCID50的病毒含量;特异性好,不与其他病毒如PRV、PRRSV、JEV等发生交叉反应.阳性样品的检测结果与反向间接血凝(IHA)检测结果的符合率为100%.应用所建立的RT-PCR方法,对采自3个奶牛场的55份鲜奶样品及40份牛鼻拭子样品进行检测.结果表明,所建立的检测方法可用于奶牛隐性感染FMDV的检测.     

口蹄疫病毒亚洲1型TaqMan实时定量RT—PCR快速定型检测方法研究

采用TaqMan方法,根据口蹄疫病毒亚洲1型VP1的基因编码区基因(1D)序列,设计合成多对引物和多条探针,通过对引物、探针的筛选,反应条件的选择和优化,建立了口蹄疫病毒亚洲1型荧光RT-PCR检测技术,试验体系采用一对引物和两条探针配对,有效降低了由于变异导致的漏检率。经一系列的试验表明建立的荧光PCR检测技术快速、敏感、特异,检测时限3个小时以内,与口蹄疫病毒A型、O型和其它病毒不发生交叉反应,适用于样品中口蹄疫病毒亚洲1型的直接检测。口蹄疫病毒亚洲1型荧光PCR快速检测技术的建立,为我国养殖场口蹄疫亚洲1型疫情的快速诊断进而采取相应防制措施、减少疫情散播,以及动物产品中口蹄疫病毒亚洲1型的快速检测提供了一种可靠方法。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达载体构建

用Trizol提取O型口蹄疫病毒RNA,根据已经公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对VP1基因的引物,通过RT-PCR扩增出VP1基因,将其克隆至表达载体pET-32a中。经测序表明,目的基因VP1已正确地整合至表达质粒中。     

口蹄疫病毒分型诊断芯片探针设计初报

为建立口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)不同血清型与基因型的基因芯片检测方法,设计针对O型8个基因型、A型3个基因型和亚洲1型的特异性探针。从美国GenBank与英国世界口蹄疫参考实验室基因库下载了O型、A型和亚洲1型FMDV的VP1基因序列547条。对每一血清型序列用DNA Star软件ClastalW程序进行多重比对,做系统发育分析并进行基因分型。用生物学软件BioSun 2.0建立基因型数据库,设计每一基因型的特异性探针。共设计出104条候选探针,通过芯片试验筛选出12条特异性探针。以各型特异性探针所对应的靶序列模板做10倍系列稀释进行PCR扩增,扩增产物与探针杂交,验证各探针的灵敏度。对O型SEA、Euro-SA、ME-SA、WA 4个基因型的各条探针的灵敏度进行了检验,结果这些探针能够检测到102数量级拷贝数的阳性靶标。