羊口疮病毒QD/2015株B2L基因克隆及生物信息学分析

为分析羊口疮病毒(ORFV/QD/2015株)B2L基因的分子特征,预测其编码蛋白的生物学功能,对其B2L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,应用生物信息学相关软件及方法,对扩增所得的基因进行序列分析,并对其编码蛋白的二级结构、细胞抗原表位、三级结构、跨膜结构域和信号肽等进行预测和分析。结果显示:ORFV/QD/2015株B2L基因序列长1 137 bp,编码379个氨基酸;该毒株与其他12株羊口疮病毒参考株的B2L基因核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,氨基酸序列同源性为96.8%~99.2%。系统进化分析显示,ORFV/QD/2015株与2015年分离到的ORFV/Shaan Xi/2015/China株亲缘关系最近;B2L基因编码蛋白二级结构以α-螺旋区域和β-折叠区域所占比例较大,预测此蛋白可能存在7个细胞优势抗原表位,无跨膜区域,无信号肽区域;三级结构呈弯曲状螺旋结构。     

猪博卡病毒VP2基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪博卡病毒VP2蛋白的结构与功能,应用套式PCR技术对猪博卡病毒VP2基因进行分子克隆,并对其进行生物信息学分析。结果显示,获得了1 656bp的猪博卡病毒VP2基因(GenBank登录号为KF806730),此序列与其他PBoV分离株核苷酸序列同源性为82%⁸9%,进化树分析结果显示,KF806730与PBoV5在一个分支,说明两者之间具有较近的亲缘关系。经生物信息学分析,此序列编码551个氨基酸,相对分子质量为61 261.7,理论等电点(PI)为5.98,体外半衰期为30h(体外哺乳动物类网状细胞),不稳定系数为34.36,脂肪系数为54.88,平均亲水性为-0.766,最大疏水指数为1.733,最小疏水指数为-3.378;在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定程度的偏向性;无信号肽和跨膜区;综合多种方法分析预测其主要抗原表位可能位于第78-80aa、311-314aa、507-509aa区域;二级结构、三维结构预测显示VP2蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个螺旋和折叠区域。本试验成功获得猪博卡病毒VP2基因,为以后研究此基因的生物学功能和建立该病毒的诊断方法奠定了基础。     

鸡堆型艾美耳球虫新基因的克隆与生物信息学分析

试验旨在对堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）孢子化卵囊新基因EST序列进行克隆与生物信息学分析。通过RACE技术扩增从E. acervulina cDNA表达文库中筛选获得的EST序列,得到EST全长cDNA序列,利用多种生物信息学分析软件对其编码蛋白进行分析和预测。结果表明,该EST序列为E.acervulina孢子化卵囊阶段新基因,GenBank登录号为EU590120;该基因含1个492 bp的开放阅读框,编码163个氨基酸,理论分子质量为17.049 ku,等电点为6.69,酸性氨基酸8个,碱性氨基酸8个,分子式为C₇₆₁H₁₂₂₃N₁₉₉O₂₁₉S₁₂;总平均亲水性（GRAVY）为0.731;该蛋白有信号肽,为分泌性蛋白;具有4个跨膜结构,在105～115、28～32和132～138位之间有很强的疏水性;具有1个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N端豆蔻酰基化位点。因此根据生物信息学全面预测和分析,发现该基因所编码的蛋白具有较多的生物学功能位点和潜在的抗原表位区域。     

马疱疹病毒1型gB糖蛋白线性B细胞表位的预测与鉴定

试验旨在应用生物信息学技术综合分析马疱疹病毒1型（equine herpesvirus 1,EHV-1） gB糖蛋白,预测B细胞表位,筛选出具有潜在诊断价值的线性B细胞表位。将EHV-1 gB糖蛋白的基因序列输入DNAStar软件中的Protean工作区中,经参数综合比较分析筛选潜在的B细胞表位,克隆、表达预测表位的基因片段,利用表达的融合蛋白作为抗原与马疱疹病毒阳性血清反应。经预测分析,gB糖蛋白的B细胞表位可能位于第6-10、23-32、53-65、72-98、111-120、152-166和173-180位氨基酸区域。本试验成功构建并原核表达含7个潜在B细胞表位的融合蛋白。Western blotting试验结果显示,其中5个融合蛋白能被马疱疹病毒阳性血清识别。本试验利用生物信息学技术结合分子生物学技术成功筛选到5个潜在的B细胞表位,为EHV-1表位诊断、表位疫苗抗原的设计奠定了技术基础。     

斯氏副柔线虫GP基因的克隆、抗原表位预测及生物信息学分析

试验旨在克隆斯氏副柔线虫糖蛋白（glycoprotein，GP）抗原基因，并对其进行生物信息学分析。提取斯氏副柔线虫组织RNA，反转录合成cDNA，设计特异性引物以扩增GP基因CDS区，同时将其插入到克隆载体pMD19-T后测序，并对该基因编码蛋白的抗原表位、理化性质、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学预测。结果表明，GP基因开放阅读框（ORF）全长1 149 bp，编码382个氨基酸，其分子式为C₁₇₆₀H₂₈₇₈N₄₅₈O₅₉₀S₁₇₆₀，理论分子质量约为40.15 ku，等电点为4.37，无信号肽，总平均亲水性为0.032，不稳定系数为42.43，是疏水、不稳定蛋白；其磷酸化位点分布位于丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上；二级结构分析显示，斯氏副柔线虫GP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主，与三级结构预测结果一致；抗原表位预测表明，GP蛋白可能有6个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位，有望用作免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。本研究成功克隆了斯氏副柔线虫GP基因，同时进行了系统的生物信息学分析和抗原表位预测，为斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法的建立和DNA疫苗的研究提供理论依据。     

猪博卡病毒GD6株的全基因序列及生物信息学分析

为了解猪博卡病毒(PBo V)GD6株的生物信息学特征,应用生物信息学在线分析程序和生物信息学软件分析GD6株遗传进化关系,分析并预测病毒蛋白的理化性质、可溶性、信号肽、跨膜区、亲(疏)水性、翻译后修饰位点、二级结构及抗原表位,通过SWISS-MODEL程序预测NS1、VP1的三维空间结构。结果表明:GD6株与有蹄类动物博卡细小病毒5(Ungulate bocaparvovirus 5)在一个大分支,亲缘关系较近;NP1蛋白的不稳定系数为58.72,属于不稳定蛋白类,NS1,VP1和VP2蛋白属于稳定蛋白;PBo V的4种蛋白均为可溶性蛋白;二级结构预测显示4种蛋白均以无规则卷曲为主要结构;结构域分析显示,NS1蛋白拥有细小病毒NS1所具有的功能结构域,与病毒的复制有关;NP1含有多个磷酸化位点;综合多种方法分析预测VP1/VP2存在多个抗原表位。     

安卡拉病毒贵州流行株penton基因分子特性分析

为了解安卡拉病毒贵州流行株penton基因分子特征,本试验参考GenBank上FAdV基因序列设计合成特异性引物,对penton基因CDS区进行扩增,运用生物信息学软件对penton基因的核苷酸序列、蛋白质理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和B细胞表位进行分析。结果显示,3株FAdV（GZ-BJ、GZ-QL、GZ-LPS）penton基因片段大小均为1 578 bp。系统进化树分析显示,GZ-BJ、GZ-QL、GZ-LPS均属于FAdV-4型,3株FAdV-4核苷酸同源性在99.9%~100%之间,推导氨基酸序列同源性在99.8%~100%之间;与国内其他分离株、国外分离株差异不大。蛋白理化性质分析显示,该蛋白属于不稳定的、不具有跨膜结构的亲水蛋白,其二级结构主要以无规则卷曲为主（54.29%）;结构域预测结果显示,penton蛋白只含有一个低复杂度区域;B细胞表位预测发现,penton基因编码的氨基酸可能存在3个优势抗原表位区,分别为5-171、207-236和420-462位氨基酸处。本试验结果表明,安卡拉病毒penton基因相对保守,存在多个优势抗原表位,可作为安卡拉病毒防控研究靶蛋白,为该病毒防控与致病机理研究奠定基础。     

羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因，并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列（登录号：CP007040.1），使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物，选取高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段，并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明，PCR扩增产物约为615 bp，编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高，而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现，ompW蛋白分子式为C₁₀₀₇H₁₅₆₇N₂₅₇O₂₈₃S₃，分子质量为21.90 ku，理论等电点（pI）为9.16，属碱性蛋白质，疏水指数为96.57，总平均疏水性（GRAVY）为0.173（> 0），属于疏水类蛋白；前21位氨基酸为信号肽，第5－27位氨基酸区域存在1个跨膜区，存在N-糖基化位点及磷酸化位点，不存在O-糖基化位点，具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位；二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%；三级结构是呈β-桶状的单聚体，隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。     

弓形虫天冬氨酸蛋白酶2(TgASP2)的生物信息学分析及多克隆抗体的制备

为了预测分析弓形虫天冬氨酸蛋白酶2(TgASP2)的生物结构及功能,并制备多克隆抗体,试验首先采用生物信息学软件对TgASP2蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点及B、T淋巴细胞抗原表位等进行分析,然后构建原核表达载体,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化重组蛋白,再免疫大鼠制备特异性多克隆抗体。结果表明：TgASP2蛋白的分子式为C₂₂₉₆H₃₅₈₈N₆₂₆O₆₆₁S₂₄,等电点为7.22,为亲水性稳定蛋白;N端第1～19位氨基酸为信号肽序列,无跨膜结构域,共有37个磷酸化位点;具有14个B淋巴细胞线性表位、4个CTL细胞抗原表位及3个Th细胞抗原表位。试验成功构建出重组质粒pET-28a(+)-TgASP2,获得了可溶性重组蛋白rTgASP2;成功制备出多克隆抗体,且制备的多克隆抗体能特异性识别弓形虫内源性TgASP2蛋白,抗体效价高达1∶128 000。说明TgASP2蛋白具有一定的免疫原性,能引发良好的免疫应答。     

副猪嗜血杆菌sapA基因克隆与生物信息学分析

试验旨在克隆副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）sapA基因,并对其进行生物信息学分析,以期为sapA基因缺失疫苗的开发与应用提供理论依据。以71株临床菌株为研究对象,经PCR扩增鉴定其中的阳性菌株;将扩增得到的sapA基因片段与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸序列比对、系统进化树分析、蛋白二级和三级结构预测、疏水性预测、柔性区域位预测、B细胞抗原表位预测和Jameson-Wolf抗原指数预测。试验结果显示,在71株临床菌株中,有29株成功扩增出sapA基因,29株Hps的sapA基因核苷酸序列与已公布的SH0165菌株相似性为96.5%~98.8%,除H88菌株外,氨基酸序列与SH0165菌株相似性为98.9%~100%。sapA蛋白二级结构主要有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,有13个亲水区、38个柔性区和23个B细胞潜在抗原表位。以上结果表明,Hps的sapA基因是一个保守基因,各菌株间核苷酸序列、氨基酸序列都有很高的相似性,sapA蛋白具有较强的抗原性。     

Bioinformatics Analysis of gB Gene of Porcine Lymphotropic Herpesviruses Strain GD27

The glycoproteins B (gB) gene of porcine lymphotropic herpesviruses 2 (PLHV-2)was amplified by PCR and sequenced, then bioinformatics analysis were conducted. The gB protein was composed of 876 amino acids, the molecular formula was C₄₅₀₀H₆₉₇₅N₁₁₉₉O₁₃₅₁S₄₀, the molecular mass was 100.77 ku, the value of theoretical isoelectric point was 6.45, and the instability index was 38.58. The prediction of secondary structure revealed that some alpha helixes and beta sheets exist in protein while random coil was major pattern. It had a signal peptide in the position 1-39 amino acids and a transmembrane helice in the position 761-780 amino acids. It contained several prosites and several intrinsically disordered proteins. Tertiary structure model of gB protein showed a fusion loop. Multiple antigenic epitope located in gB through comprehensive analysis prediction method. It was suggested that gB gene could be as a candidate antigen for vaccination of PLHV-2.     

固始鸡XCL1基因CDS区克隆与生物信息学分析

本研究旨在克隆鸡淋巴细胞趋化因子（lymphotactin,XCL1）基因CDS区并探索其生物学特性。试验以固始鸡胸腺组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术对该基因的CDS区进行扩增和克隆,并通过生物信息学软件进行相关生物信息学分析。结果表明,固始鸡XCL1基因CDS区长294 bp,编码97个氨基酸。相似性分析结果发现,鸡XCL1基因CDS区序列与牛、山羊、绵羊、人、小鼠、猪和大鼠的相似性分别为53.7%、53.0%、52.9%、51.8%、51.1%、50.9%和50.4%。进化树结果表明,鸡作为非哺乳动物,与哺乳动物亲缘关系较远。XCL1蛋白分子式为C₄₉₁H₈₂₂N₁₅₀O₁₃₂S₆,理论等电点为10.95,属于碱性蛋白;分子质量为11.13 ku,脂肪系数为102.37,不稳定系数为51.44,属于不稳定蛋白,半衰期为30 h;具有跨膜结构（第5-27位氨基酸）和信号肽区域（第1-18位氨基酸）,属于亲水性分泌型蛋白。XCL1蛋白存在8个潜在的磷酸化修饰位点和3个潜在的糖基化修饰位点。XCL1蛋白的二级结构由α-螺旋（35.05%）、β-转角（5.15%）、延伸链（26.80%）和无规则卷曲（32.99%）组成,三级结构预测结果与二级结构一致。亚细胞定位分析表明XCL1蛋白主要在细胞外发挥作用;该蛋白有1个位于第31—88氨基酸残基处的SCY保守性结构域;该蛋白能与OXT、PTAFR、GPR132和XCR1等分子形成互作网络。本试验结果为进一步研究鸡XCL1基因功能提供理论参考。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的生物信息学分析及多表位筛选

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列，用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域，使用DNAStar软件预测NS3蛋白的二级结构，为了更准确地预测蛋白质的二级结构，使用SOPMA分析软件进行了二次预测。使用Phyre2在线服务器预测NS3蛋白的三级结构，并用Raswin软件标出各个元素所处的位置。使用4种预测软件（BCPREDS、ABCpred、BepiPred和SVMTriP）分析NS3蛋白的线性B细胞表位，使用NetMHCⅡpan预测CD4⁺ T细胞表位，使用NetBoLApan和IEDB预测CD8⁺ T细胞表位，将所得到的结果进行T细胞和B细胞表位筛选。结果表明，NS3蛋白质由683个氨基酸组成，分子质量为75 ku，理论等电点（pI）为8.31，化学式为C₃₃₄₇H₅₃₄₆N₉₁₆O₁₀₀₉S₂₈，不稳定系数为35.93，平均亲水性（GRAVY）值为-0.267，表明NS3为稳定性亲水蛋白质。TMHMM结果显示，NS3蛋白不具有跨膜结构域。SOPMA结果表明，在NS3蛋白的二级结构中，α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别约占30.75%、22.55%、8.35%和38.35%，用DNAStar软件分别标出了α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲所处的位置。运用4种不同的B细胞预测软件筛选出8个线性表位：12-16、289-298、349-360、394-407、421-432、489-498、515-525和665-679位氨基酸。用NetMHCⅡpan筛选出4个T细胞表位：248-262、315-320、400-414和482-496位氨基酸。本研究为BVDV NS3蛋白优势抗原的筛选提供了理论依据。     

水牛SND1基因克隆及生物信息学分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛SND1（staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1）基因进行克隆和序列分析，为探究该基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛SND1基因（GenBank登录号：NM_205784.1）作为种子序列，利用Primer Premier 5.0设计3对引物，以水牛基因组DNA为模板，PCR扩增水牛SND1基因mRNA序列，扩增获得序列连接pMD18-T载体，通过测序拼接获得水牛SND1基因mRNA全序列，并对其进行生物信息学分析。结果显示，水牛SND1基因完整编码序列长为3 503 bp，包含长为2 733 bp CDS序列，编码910个氨基酸，蛋白分子式为C₄₅₂₃H₇₁₈₃N₁₂₈₁O₁₃₅₄S₂₆，分子质量为102.01 ku，理论等电点（pI）为6.74，不稳定系数为42.07，平均亲水性为-0.419，属可溶酸性蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，其中α-螺旋占37.80%，无规则卷曲占34.18%。结合Protfun 2.2在线软件对SND1的功能进行预测分析表明，该蛋白在嘌呤和嘧啶、中央中间代谢、能量代谢、氨基酸生物合成发挥功能的可能性分别为0.449、0.401、0.303和0.262。SND1基因编码区序列与黄牛、绵羊、山羊、猪、马、人的同源性分别为98.7%、97.8%、97.8%、93.8%、93.1%和91.7%，物种之间同源性较高，系统进化情况与其亲缘关系远近一致。利用SMART在线软件预测蛋白结构域，结果显示，水牛SND1蛋白包含有4个SN区域，说明SND1基因编码区在进化过程中较为保守。     

哈萨克羊INHβA基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆哈萨克羊抑制素βA （inhibin beta A，INHβA）基因序列，并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中绵羊INHβA基因序列（登录号：NM_001009458.1）设计1对特异性引物，通过RT-PCR方法对哈萨克羊INHβA基因进行扩增，将获得的INHβA基因片段插入到pMD19-T载体中进行克隆测序，并结合生物信息学方法预测和分析其核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白跨膜、蛋白修饰位点及二级结构、三级结构模型等。结果显示，哈萨克羊INHβA基因长1 278 bp，编码425个氨基酸。哈萨克羊INHβA基因与绵羊、牛、野猪、小鼠、人、大鼠、猫、兔、马的同源性分别为98.6%、97.7%、90.4%、87.9%、91.1%、88.2%、91.8%、89.8%和91.8%，表明INHβA基因在不同物种之间具有较高的保守性。INHβA蛋白分子式为C₂₀₇₂H₃₃₂₅N₆₀₃O₆₂₈S₂₆，分子质量为47.57 ku，理论等电点（pI）为7.87，不稳定系数为66.16，脂溶指数为78.47，亲水值为-0.507。INHβA是一种碱性不稳定的亲水性脂溶性蛋白，没有跨膜结构，含有信号肽。二级结构预测显示，INHβA蛋白α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占22.59%、4.47%、54.12%和18.82%。三级结构预测显示，INHβA蛋白以α-螺旋为主，是含有8种蛋白修饰位点的β-桶状蛋白。本试验结果为深入研究哈萨克羊INHβA蛋白功能及探讨INHβA基因对提高哈萨克羊繁殖力的影响提供参考数据。     

猴源葡萄糖调节蛋白78生物信息学分析及其真核表达

试验旨在探究葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78,GRP78）基因的理化性质和结构特点,阐述GRP78在猪流行性腹泻病毒复制中的分子伴侣作用和调控机制。通过RT-PCR方法扩增GRP78基因,并插入到pMD20-T Simple载体进行克隆测序,利用生物信息学方法对其氨基酸序列、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、三级结构等进行预测和分析。将GRP78基因插入pCDNA 3.1中,然后转染Vero-E6细胞。Western blotting检测Vero-E6细胞中GRP78的表达。生物信息学分析结果表明,GRP78基因全长1 965 bp,编码654个氨基酸,蛋白质分子质量为72.33 ku,理论等电点为5.07,分子式为C₃₁₈₉H₅₁₅₃N₈₆₅O₁₀₁₉S₁₃。遗传进化树分析显示,猴源GRP78基因与双峰驼、犬、猫、大猩猩、蝙蝠、狒狒、猪、马的氨基酸序列同源性为99.5%~99.8%;遗传进化分析显示,大猩猩和狒狒亲缘关系最为接近。跨膜区和信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽但不存在跨膜结构。GRP78蛋白无N-糖基化修饰位点,存在6个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,表明GRP78可能有与激酶磷酸化有关的PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,可能参与己糖代谢和单糖代谢。     

水牛PTHLH基因克隆分析及其真核表达载体构建

为揭示甲状旁腺激素样激素（parathyroid hormone-like hormone,PTHLH）基因对水牛繁殖性能的影响,本研究对水牛PTHLH基因进行克隆,并对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析。以牛PTHLH基因为种子序列（GenBank登录号：NM_001290949）,应用CE Design软件设计引物序列,运用PCR扩增和测序技术获得水牛完整编码区序列,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、PSORTⅡ Prediction等在线软件分析PTHLH蛋白的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性比对分析及系统进化树构建。结果显示,试验克隆了水牛PTHLH基因完整编码区序列,该序列长为534 bp,可编码177个氨基酸。水牛PTHLH基因编码区核苷酸序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼的同源性分别为98.3%、90.4%、90.1%、98.1%、97.5%和89.2%,物种之间同源性较高,系统进化树分析结果与其亲缘关系远近一致,表明水牛PTHLH基因编码区在进化过程中比较保守。蛋白理化性质分析显示,水牛PTHLH蛋白分子式为C₈₉₅H₁₄₅₁N₂₇₁O₂₆₆S₂,分子质量为2 885 u,半衰期为30 h,理论等电点（pI）为10.00,水溶液在280 nm处的消光系数为23 950,肽链N端为蛋氨酸（Met）,不稳定系数为60.04,属于碱性不稳定蛋白;脂肪系数为72.15,总平均亲水性为－0.928,该蛋白属于不可溶性蛋白,亚细胞定位于细胞核、细胞质和线粒体。结构域预测结果显示,水牛PTHLH蛋白包含有1个PTH区域,同时还包含有1个低复杂度区域。二级结构分析显示,水牛PTHLH蛋白包含83个α-螺旋（46.89%）、17个延伸链（9.60%）、10个β-转角（5.66%）和67个无规则卷曲（37.85%）,与三级结构预测结果相一致。试验构建了PTHLH基因真核表达载体pcDNA3.1-PTHLH,并通过电泳和测序验证了载体的准确性。PTHLH基因的成功克隆及其真核表达载体的成功构建为今后研究水牛PTHLH基因的功能和遗传特性提供了材料。     

东北虎γ-干扰素基因的克隆、生物信息学分析及其在毕赤酵母中的表达

本试验旨在通过克隆东北虎γ-干扰素（IFN-γ）基因,研究其分子特征并预测蛋白生物学功能,为后续研究干扰素抗病毒活性做前期准备。通过RT-PCR从ConA诱导过的东北虎血淋巴细胞中扩增东北虎IFN-γ基因并测序,应用生物信息学方法进行序列分析。结果表明：东北虎IFN-γ编码区由504个核苷酸组成,共编码167个氨基酸,蛋白相对分子质量为19.59 ku,等电点为9.03,所编码的蛋白为碱性亲水性蛋白,其中前23个氨基酸可能为信号肽,IFN-γ编码蛋白保守结构域为IFN-γ超家族,且存在跨膜结构,其中1－6位氨基酸为胞内区域,7－28位氨基酸为跨膜区域,29－167位氨基酸为胞外区域;IFN-γ编码蛋白二级结构主要以α-螺旋（58.08%）和无规则卷曲（33.53%）为主,存在5个潜在的B细胞抗原表位,3个潜在的N-糖基化位点;分子进化分析显示,东北虎IFN-γ与GenBank上发表的东北虎、非洲狮、金钱豹、美洲狮、猎豹、家猫、加拿大猞猁、野猪等的核苷酸相似性为80.4%~99.8%,氨基酸相似性为70.5%~100%,东北虎IFN-γ与非洲狮、金钱豹亲缘关系最近,美洲狮、猎豹、家猫、猞猁次之,野猪最远。通过合成改造后的东北虎IFN-γ基因,构建能表达IFN-γ蛋白的重组质粒pPIC9K-IFN-γ,将其导入高效表达系统-毕赤酵母中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达蛋白的分子量约17.8 ku,与预期大小相符,表明东北虎IFN-γ成功表达。     

草原红牛Acot2基因克隆及其在各组织中的表达差异研究

本研究旨在探究草原红牛酰基辅酶A硫酯酶2（Acot2）的基因功能，并对其进行生物信息学分析，检测Acot2基因在草原红牛不同组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Acot2基因序列（登录号：NM_001101938.1）设计引物，PCR扩增获得草原红牛Acot2基因的完整CDS并进行测序，利用分析软件进行序列同源性比对并构建系统进化树；获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点，预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型；利用实时荧光定量PCR方法检测Acot2基因在不同组织中的表达差异。结果显示，草原红牛Acot2基因CDS大小为1 395 bp，编码464个氨基酸，其核苷酸序列与亚洲水牛的同源性较高（98.3%），与猕猴和黑猩猩的同源性较低（80.5%和80.4%）。Acot2蛋白分子式为C₂₃₁₇H₃₆₀₆N₆₄₀O₆₂₈S₁₄，分子质量为50.924 ku，理论等电点为8.84。蛋白质不稳定指数为37.50，氨基酸残基多数为亲水性残基，总平均亲水性为-0.094。亚细胞定位分析表明，Acot2蛋白分布在内质网（30.4%）、线粒体（26.1%）、高尔基体（17.4%）、细胞质（17.4%）、液泡（4.3%）和细胞质（4.3%）中；磷酸化位点分析发现，Acot2蛋白存在20个磷酸化位点。二级结构主要形式有α-螺旋（21.8%）、β-转角（33.4%）、β-折叠（18.4%）和无规则卷曲（26.4%），三级结构预测结果与其相一致。实时荧光定量结果显示，Acot2基因在草原红牛胃中表达量最高，在肺脏中表达量极少。Acot2基因在生物进化过程中具有低保守性，其编码氨基酸组成的蛋白质结构稳定，属于水溶性蛋白，在线粒体和内质网中发挥作用，在草原红牛不同组织的表达量有明显差异。本研究结果为进一步探究Acot2基因对家畜脂代谢的影响和筛选草原红牛肉质候选基因提供资料。